[发明专利]一种基于场流分离技术分离纯化灵芝多糖的方法

说明书

本发明提供了一种基于场流分离技术分离纯化灵芝多糖的方法。该方法对于提取的灵芝粗多糖首先采用Sevag法进行4次除蛋白质，之后通过AF4池道，采用超纯水作为载液，采用10kDa可再生纤维素膜，0.2mL/min的超滤流速进行一段时间的超滤，最后进行非对称场流分离，非对称场流分离时采用超纯水作为载液，初始交叉流流速指数衰减降低至0.05mL/min。本发明在分离纯化灵芝多糖过程中减少了除蛋白质次数，并且整个过程中载液为超纯水，无需透析除盐步骤，在保护灵芝多糖活性的基础上提高了分离纯化效率，并得到了高纯度的灵芝多糖。

技术领域

本发明涉及灵芝多糖分离和纯化技术领域，具体地说是一种基于场流分离技术分离纯化灵芝多糖的方法。

背景技术

灵芝(Ganoderma lucidum)是一种多孔菌科真菌赤芝或紫芝的干燥子实体。在我国，灵芝已有2000多年的药用历史。根据《神农本草》记载，灵芝具有扶正固本、滋补强壮、延年益寿的功效。多糖是灵芝主要活性成分之一，因此制备高纯度的灵芝多糖是研究其构效关系的必要条件。

天然植物多糖的分离纯化是一个耗时繁琐的过程，包括粗多糖的提取、除蛋白质、除盐、纯化等步骤。目前，多糖除蛋白质常用的Sevag法和三氯乙酸法效率低，需要反复多次除蛋白质(往往需要十次以上)，易造成多糖糖苷键断裂，影响多糖的生物活性，同时使用大量有机溶剂。透析除盐也是一个耗时的过程(大于24h)。膜分离技术是多糖纯化的一个重要组成部分，需要更换流动水保持其膜透析效率。目前，多糖的纯化通常采用离子交换色谱，流动相为盐溶液，纯化后的多糖溶液需要进一步透析除盐。非对称场流分离技术(Asymmetrical flow field-flow fractionation,AF4)是一种类色谱技术，AF4池道中没有固定相，降低了多糖在分离过程中降解风险。在AF4分离样品过程中，载液通过池道中的超滤膜产生外力，当外力和样品扩散达到平衡时，由于水合直径小的组分扩散系数大，平衡层更接近池道中心，进而被先洗脱出来。AF4载液中往往添加盐来调节其离子强度，提高样品组分的分离度。因此，收集的AF4样品片段需要透析除盐。

发明内容

本发明的目的是提供一种基于场流分离技术分离纯化灵芝多糖的方法，该方法无需透析除盐即可实现分离纯化灵芝多糖。

本发明是这样实现的：一种基于场流分离技术分离纯化灵芝多糖的方法，包括以下步骤：

(a)称取脱脂灵芝子实体粉，加入25倍超纯水混匀，超声辅助热水法提取，提取温度为70℃，提取时间为34min，抽滤去除灵芝残渣；

(b)将抽滤液旋蒸浓缩，加Sevag试剂，振荡，除蛋白质4次，静置后去除沉淀；

(c)将步骤(b)上清液旋蒸浓缩至10％，待用；

(d)通过非对称场流分离系统对步骤(c)所得浓缩液进行一段时间(T_u)超滤，且30min≤T_u≤45min，载液为超纯水，超滤膜为10kDa可再生纤维素(RC)膜，超滤流速为0.2mL/min；

(e)将步骤(d)中的样品进行非对称场流分离，进样体积为100μL，载液为超纯水，采用指数衰减交叉流流速洗脱，初始交叉流流速(V_c)降低至0.05mL/min，且2.6mL/min≤V_c≤3.0mL/min，半衰期为0.8min；

(f)将步骤(e)中的非对称场流分离的多糖片段进行收集，旋蒸浓缩至1％，冷冻干燥得到高纯度灵芝多糖。

优选地，步骤(b)中加入Sevag试剂，氯仿与正丁醇(V：V)＝4：1，样液与试剂(V：V)＝4：1，振荡时间10min。

优选地，步骤(d)中采用非对称场流分离技术联用紫外可见光检测器和示差折光检测器(AF4-UV-dRI)，进行分离监测时所用载液为超纯水。