[发明专利]一株高生育酚含量的微藻突变株、其筛选方法及应用

说明书

本发明提供一株小球藻aBST2‑3，所述小球藻保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC No.45167。本发明还提供小球藻aBST2‑3在发酵产α‑生育酚中的应用。本发明通过对微藻进行两次ARTP诱变，然后比较α‑生育酚合成过程中关键基因的表达量并测定其α‑生育酚含量，初步筛选α‑生育酚产量较高的突变株，再筛选出能稳定遗传的突变株，最后比较藻株生物量、油脂含量、α‑生育酚含量以及糖消耗情况，筛选出一株高产α生育酚且能稳定遗传的突变株，其最高产量达到420.3μg/gDCW，在原始菌株的基础上提高了84％，此突变株是制备α‑生育酚的有效来源，具有良好的α‑生育酚开发前景。

【技术领域】

本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一株种高生育酚含量微藻的突变株，还涉及其应用，以及筛选得到该突变株的方法。

【背景技术】

VE的生理学活性高，天然VE作为营养补充剂和抗氧化剂广泛应用于医药、保健品、食品、营养品和化妆品中，是人类生命活动中不可缺少的物质。近年来，微藻合成VE已成为研究的热点。VE是生育酚类化合物的总称，其中α-生育酚生物学活性最高。能积累生育酚的微藻有螺旋藻、杜氏藻、集胞藻、绿藻等。藻种中研究最广泛的是裸藻，其生育酚浓度为每克细胞中1.12～7.35mg。研究发现纤细裸藻有最高的生育酚生产力，其合成的生育酚超过97％是α型。但是目前利用微藻来合成VE含量普遍较低，相继有研究通过过表达尿黑酸植基转移酶(HPT)及合成前体途径中的羟苯丙酮酸双加氧酶(HPPD)可提高总生育酚含量。

微藻诱变育种是指采用各种物理以及化学诱变的方法引起藻种遗传性状产生变异，再通过定向筛选、培育以获得所需要的优良突变藻株的育种技术。国内外已有大量文献报道，运用诱变育种技术己成功获得高活性物质含量、高油脂产量及耐低温、高温等优良性状的藻种，微藻诱变育种也成为提高育种效率、获得优良微藻种质的主要手段。但目前针对提高微藻VE或α-生育酚含量的诱变及筛选方法研究较少，缺乏参考基础，并且目前可实现规模化养殖的微藻种类十分有限，表型性状的不稳定性也会对微藻生产造成影响，因此通过诱变技术及有效的筛选方法获得高生育酚含量的稳定遗传微藻势必会加快微藻对VE产业化生产的进程。

【发明内容】

本发明的目的是针对以上微藻的α-生育酚含量较低以及突变株遗传不稳定的问题，提供一株α-生育酚含量高且能够稳定遗传的突变株。

本发明的思路是通过对小球藻BST-2进行ARTP诱变、通过实时荧光定量PCR对突变株进行筛选，比较生育酚合成途径中6个关键基因的表达量，筛选到高表达的突变株，进行稳定性遗传分析后比较其在发酵过程中的生物量、油脂含量、糖消耗情况以及α-生育酚含量，最终筛选出一株生长迅速、油脂含量高、生育酚含量高且能够稳定遗传的突变株，将其作为后续研究。

基于此，本发明提供一株小球藻aBST2-3，该小球藻aBST2-3于 2022年5月23日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.45167。

本发明还提供所述小球藻aBST2-3在发酵产α-生育酚中的应用。

本发明还提供一种小球藻培养基，所述培养基含有以下组成：

水补足至1000mL。

进一步地，本发明还提供一种通过诱变选取高生育酚含量微藻的方法，所述方法包括以下步骤：

(1)取微藻，分离纯化后测定藻株内生育酚含量和生育酚合成途径中关键基因的表达量，以表达量高的藻株作为出发藻株；

(2)步骤(1)所得藻株进行ARTP诱变，挑取诱变后的活藻株；

(3)测定步骤(2)的藻株的生育酚含量和生育酚合成途径中关键基因的表达量，选取生育酚含量和表达量高的藻株；