[发明专利]一种产N-乙酰神经氨酸的重组大肠杆菌及其构建方法

权利要求书

1.一种产N-乙酰神经氨酸的重组大肠杆菌，其特征在于，沉默或缺失了大肠杆菌基因组中的N-乙酰葡糖胺-6-磷酸脱乙酰酶基因nagA、氨基葡萄糖-6-磷酸脱氨酶基因nagB、N-乙酰氨基葡萄糖特异性EIICBA组分基因nagE、N-乙酰神经氨酸裂解酶基因nanA、唾液酸转运蛋白基因nanT、N-乙酰甘露糖胺-6-磷酸2-差向异构酶基因nanE、N-乙酰甘露糖胺激酶基因nanK、甘露糖特异性EIIAB组分相关基因manXYZ、丙酮酸氧化酶poxB基因，并表达来源于脑膜炎奈瑟菌(Neisseria meningitidis)的UDP-N-乙酰氨基葡糖-2-差向异构酶NeuC和来源于粘放线菌(Moritella viscosa)的N-乙酰神经氨酸合酶NeuB，并表达内源酶glmM、glmU和葡萄糖胺合酶突变体glmS_A。

2.根据权利要求1所述的重组大肠杆菌，其特征在于，所述葡萄糖胺合酶突变体glmS_A整合于原nagABE所在位置；所述NeuC整合于原甘露糖特异性EIIAB组分相关基因manXYZ所在位置；所述NeuB整合于原丙酮酸氧化酶poxB基因所在位置。

3.根据权利要求1或2所述的重组大肠杆菌，其特征在于，所述葡萄糖胺合酶突变体glmS_A的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。

4.根据权利要求1～3任一所述的重组大肠杆菌，其特征在于，利用SEQ ID NO.7～15任一所示启动子表达所述UDP-N-乙酰氨基葡糖-2-差向异构酶NeuC。

5.根据权利要求1～4任一所述的重组大肠杆菌，其特征在于，利用SEQ ID NO.10所示启动子表达所述N-乙酰神经氨酸合酶NeuB。

6.根据权利要求1～5任一所述的重组大肠杆菌，其特征在于，所述glmM，glmU和glmS突变体glmS_A由诱导型启动子T7调控表达。

7.一种生产N-乙酰神经氨酸的方法，其特征在于，以权利要求1～6任一所述重组大肠杆菌为发酵菌株，以甘油为底物，在30～37℃发酵培养至少24h。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，将重组大肠杆菌接种于LB培养基中，培养12～14h获得种子液，再以1～2％的接种量转接至发酵培养基中发酵。

9.根据权利要求7或8所述的方法，其特征在于，当OD₆₀₀达到0.6后加入诱导剂IPTG，于28～30℃培养24～48h。

10.权利要求1～6任一所述的大肠杆菌在生产含N-乙酰神经氨酸的产品中的应用。