[发明专利]一种重组抗菌肽E-EJ97、重组表达载体、工程菌及其应用

说明书

本发明涉及一种重组抗菌肽E‑EJ97、重组表达载体、工程菌及其应用，属于基因工程及生物技术领域，所述重组抗菌肽E‑EJ97的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述重组表达载体含所述重组抗菌肽E‑EJ97的基因SEQ ID NO.3。本发明还提供了能够表达所述重组抗菌肽E‑EJ97的重组里氏木霉Tu6工程菌。本发明所述重组抗菌肽E‑EJ97对大肠杆菌、沙门氏菌及产气荚膜梭菌均有抑制作用，且具有良好的热稳定性、盐离子稳定性和消化酶稳定性，有利于其在制备饲料及饲料添加剂中的应用。

技术领域

本发明属于基因工程及生物技术领域，具体涉及一种重组抗菌肽E-EJ97、重组表达载体、工程菌及其应用。

背景技术

在畜牧业中，抗生素具有广谱防范动物细菌感染、以达到预防微生物源疾病的作用，但是其超剂量使用与滥用可能产生多重耐药性细菌，且抗生素残留问题日益严重，因此在多个国家和地区已明令禁止使用抗生素。随着“无抗养殖”概念的提出与推广，抗菌肽作为一种可以有效替代抗生素的天然活性物质，具有兼顾安全性、专一性、高效的抗菌活性等优势，为解决抗生素替代物的问题展现了一种新的思路。

粪肠球菌是一种革兰氏阳性菌，广泛存在于人和其他动物的肠道、上呼吸道，能够产生多种抗生素和抗菌肽。粪肠球菌可作为添加剂添加到动物饲料中，因此可以认为粪肠球菌属于一种无毒无害的有益菌。粪肠球菌中存在的多种抗菌肽在商用以及医疗方面有所应用，例如抗菌肽ST4SA可以抑制李斯特菌、金黄色葡萄球菌等致病菌；肠毒素K1(EntK1)对屎肠球菌抑制作用显著。粪肠球菌细菌素能够对多种革兰氏阳性菌表现出快速且持续的抑制活性，对单核细胞增生李斯特菌等食源性病原体具有抑制活性；但其抗菌谱较窄，对革兰氏阴性菌的抑制活性相对较弱。如果能够将粪肠球菌中的某些独特、高效、安全的抗菌肽优化改良并大规模生产制备，或可作为饲料添加剂应用于畜牧、水产等养殖领域，为“无抗养殖”提供更优越的解决方法。

抗菌肽EJ97是一种来源于粪肠球菌的非羊毛硫细菌素，属于无前导细菌素。其遗传结构简单，易于在益生菌中表达，便于规模化生产，能够有效抑制养殖中常见的大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和单增李斯特菌。其抑菌谱范围较窄因此较少影响与宿主共生的微生物，能够维持肠道菌群平衡。抗菌肽EJ97具有优良的热稳定性，可以在经过较高杀菌环境后依然发挥作用，在较低温度的加工储运环境下保持结构稳定；并且EJ97盐离子稳定性较好，在盐含量较高的环境中依然可以保持活性；对蛋白酶类比较敏感。抗菌肽EJ97应用在饲料添加剂中具有广阔前景和独特优势。但是抗菌肽EJ97也存在对革兰氏阴性菌抑制活性较低的缺陷，因此将抗菌肽EJ97改良后，发明其大规模工业化生产制备方法有望降低生产成本，推动其在饲料及添加剂方面的应用。

异源表达是一种常用的工业化生产方式，常见的宿主工程菌株如毕赤酵母等在发酵生产前需要添加甲醇等诱导剂，而里氏木霉不仅安全无害，而且本身具有强启动子、类哺乳动物的蛋白修饰能力和高效的合成分泌机制等优点，在规模发酵方面独居优势。

发明内容

本发明涉及一种以里氏木霉Tu6为工程宿主菌的重组抗菌肽E-EJ97的制备方法及其抗菌特性的相关应用。

本发明基于下述技术方案予以实现：

一种重组抗菌肽E-EJ97，所述重组抗菌肽E-EJ97的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

编码SEQ ID NO.1所述氨基酸序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述SEQ IDNO.3是在原始氨基酸序列SEQ ID NO.2的抗菌肽EJ97基础上，翻译为编码的核苷酸序列，并进行该核苷酸片段的人工合成，对该人工合成的片段进行易错PCR反应获得的突变体。