[发明专利]对植物内生微生物组的宏基因组进行原位改造的方法

权利要求书

1.对植物内生微生物组的宏基因组进行原位改造的方法，其特征在于：包括以下步骤：

S1、构建植物内生微生物原位宏基因组改造的工程质粒；

S2、构建植物内生微生物原位宏基因组改造的供体菌；

S3、在植物体外对内生微生物进行宏基因组改造及受体菌分离培养；

S4、在植物体内对内生微生物组进行原位宏基因组改造。

2.如权利要求1所述的对植物内生微生物组的宏基因组进行原位改造的方法，其特征在于：所述构建植物内生微生物原位宏基因组改造的工程质粒，具体包括：

质粒元件共包括复制子、启动子、抗性标记基因、转移起始位点和载荷基因；

复制子包括pBBR1、RSF1010和p15A三种广宿主复制子；pBBR1复制子含有两个重要的元件，rep基因编码复制蛋白，参与质粒的复制，mob基因编码移动基因，负责质粒的接合转移；RSF1010复制子含有七个重要元件，其中rep基因编码REP A、B、C三个复制蛋白，参与质粒的复制，mob基因编码MOB A、B、C三个移动蛋白，负责质粒的接合转移；p15A复制子不含有转移起始位点，需要连接incP转移起始位点；

启动子包括广宿主范围的启动子CP25、PA1、PA2、PA3，这四个启动子需要连接核糖体结合位点；以氨苄抗性基因作为抗性标记基因；以绿色荧光蛋白为载荷基因，通过细菌间的接合转移机制，质粒被传递给受体菌后，通过启动子表达GFP蛋白，使得受体菌带有绿色荧光标记；

最后，通过基因工程手段，将上述质粒元件组合，共获得十二个不同的接合质粒。

3.如权利要求2所述的对植物内生微生物组的宏基因组进行原位改造的方法，其特征在于：所述构建植物内生微生物原位宏基因组改造的供体菌，具体包括：

以革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌中普遍存在的IncPα家族的RP4质粒接合转移机制为基础，选择Escherichia coli S17-1 λpir为供体菌改造的出发菌株，该菌株的染色体中整合了RP4-2质粒，可以携带染色体的部分DNA在接合菌之间转移；

通过Red同源重组技术，将mCherry蛋白插入大肠杆菌基因组，获得红色荧光标记的大肠杆菌供体菌EcBCT；

将大肠杆菌供体菌EcBCT制备成感受态细胞，通过热激方式，将上述构建好的接合质粒转入供体菌中；经单斑挑取后送测，获得转化成功的供体菌。