[发明专利]一种通过C端添加融合肽段提高木聚糖酶和植酸酶热稳定性的方法

说明书

本申请涉及基因工程领域，具体涉及一种通过C端添加融合肽段提高木聚糖酶和植酸酶热稳定性的方法。本发明首次发现，通过在GH11家族木聚糖酶和植酸酶C端添加特定融合肽段的方法，可显著提高木聚糖酶和植酸酶的热稳定性，对于其他类型木聚糖酶、植酸酶及其他工业酶类的热稳定性分子改造具有重要的指导意义。

技术领域

本申请涉及基因工程领域，具体涉及一种通过C端添加融合肽段提高木聚糖酶和植酸酶热稳定性的方法。

背景技术

木聚糖是生物圈中含量仅次于纤维素的第二大类多糖，其结构复杂，完全降解需要多种木聚糖酶的协同作用。β-1,4-内切木聚糖酶是木聚糖主链水解过程中最关键的酶，已广泛应用于饲料、造纸、能源、食品和医药等行业。但在实际应用中，由于真菌来源木聚糖酶的热稳定性较差，限制了其在工业中的应用。

植 酸 酶 (Phytase) 又 称 肌 醇 六 磷 酸 水 解 酶，是催化肌醇六磷酸逐步去除磷酸盐的磷酸酶，广泛存在于植物、动物及微生物中。植酸酶在饲料行业具有重要的应用价值，在单胃动物的饲料中添加适量的植酸酶可以提高磷的利用率，通过减少对无机磷补充的需求和由含磷粪便排泄引起的环境污染可以降低饲养成本。大肠杆菌来源植酸酶是已知分解植酸能力最强的植酸酶之一，其作用pH范围与曲霉属来源植酸酶相比，更适于在动物的胃肠道内发挥作用，且有着更好的抗蛋白酶降解能力，但其热稳定性较差，限制了其在颗粒饲料中的应用。

通过基因工程技术对酶蛋白进行分子改良是提高木聚糖酶和植酸酶的热稳定性的有效方法，如增加氢键和盐桥数量、增强疏水相互作用、引入二硫键、增加某些特殊氨基酸等都是提高木聚糖酶热稳定性的有效策略。de Souza等将来源于Thermoascus aurantiacus CBMAI756 的木聚糖酶XynA 的第209 位的氨基酸His突变为Asn，增加了短螺旋和盐桥的数量，木聚糖酶的热稳定性得到了显著提升(De Souza et al., 2016)。Tang等在Trichoderma ressei的木聚糖酶Xyn2 中分别引入了Cys14-Cys52 和Cys59-Cys149 两对二硫键，使突变酶在60℃下的半衰期分别提高了2.5 倍和1.8 倍(Tang et al., 2017)。Denisenko等将来源于Penicillium canescens的木聚糖酶PcXylA的第18位氨基酸Leu突变为Phe，增加了蛋白质三维结构中的疏水作用力，使突变酶在50℃~60℃下的半衰期提高了2~2.5 倍(Denisenko et al., 2017)。然而，通过分子改良提升蛋白热稳定性的效果是不可必然事先预期的，需要进行大量的突变和筛选工作，耗时耗力成本较高。

发明内容

本申请的目的是提供一种提高木聚糖酶的热稳定性的方法。

本发明的再一目的是提供一种提高植酸酶热稳定性的方法。

根据本发明的提高木聚糖酶的热稳定性的方法，包括以下步骤：

在木聚糖酶的C端融合氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示的融合肽段。

根据本发明的提高木聚糖酶的热稳定性的方法，其中，所述木聚糖酶为新美鞭菌属真菌N. patriciarum来源的木聚糖酶。

根据本发明的提高木聚糖酶的热稳定性的方法，其中，所述N. patriciarum来源的木聚糖酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

根据本发明的提高植酸酶的热稳定性的方法，包括以下步骤：

在植酸酶的C端融合氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示的融合肽段。

根据本发明的提高植酸酶的热稳定性的方法，其中，所述植酸酶为大肠杆菌来源的植酸酶。