[发明专利]一种赖脯胰岛素前体、其重组基因工程菌及其构建方法有效

专利信息
申请号: 202210716954.7 申请日: 2022-06-23
公开(公告)号: CN114805544B 公开(公告)日: 2022-09-09
发明(设计)人: 曹海燕;张世野;朱琳;孟广海;郑炜达;纪晓影 申请(专利权)人: 北京惠之衡生物科技有限公司;吉林惠升生物制药有限公司
主分类号: C07K14/62 分类号: C07K14/62;C12N15/17;C12N15/70;C12N1/21;C12R1/19
代理公司: 北京开阳星知识产权代理有限公司 11710 代理人: 董亚男
地址: 100025 北京市朝阳区八*** 国省代码: 北京;11
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摘要:
搜索关键词: 一种 胰岛素 重组 基因工程 及其 构建 方法
【说明书】:

发明涉及一种赖脯胰岛素前体、其重组基因工程菌及其构建方法。本发明的赖脯胰岛素前体为引导肽、赖脯胰岛素B链、C肽和赖脯胰岛素A链依次串联所得的多肽。本发明通过对C肽的选择和对引导肽的选择优化,表达本发明赖脯胰岛素前体的重组基因工程菌相比于优化前具备显著提升的目的蛋白表达量,将其用于赖脯胰岛素的生产,将显著提升生产效率,降低生产成本,应用前景广阔。

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域,尤其涉及一种赖脯胰岛素前体、其重组基因工程菌及其构建方法。

背景技术

糖尿病是当今社会高发的慢性疾病。胰岛素类产品是糖尿病市场第一大用药品种,其中又以三代重组胰岛素为主。赖脯胰岛素为第一个速效人胰岛素的类似物,属于第三代胰岛素,其结构上的特点是将人胰岛素β链28、29位的脯氨酸(Pro)、赖氨酸(Lys)次序对换,成为Lysβ28Proβ29,这种互换改变了B链末端的空间结构,减少了二聚体内胰岛素单体间的非极性接触和β片层间的相互作用,使胰岛素的自我聚合特性发生改变,易于解离,注射后能较快分解,从而加速皮下注射后的吸收,有利于控制进餐后迅速升高的高血糖。赖脯胰岛素能很好地模拟人胰岛素的分泌模式,其药代动力学特性是常规人胰岛素的一半左右,其起效时间是10~15分钟,达峰时间为1~1.5小时,作用持续时间缩短至4~6小时,使患者在获得良好的血糖控制的同时不易与餐前或者夜间胰岛素作用发生叠加,显著减少了夜间低血糖的发生率。此外,与人胰岛素相比,赖脯胰岛素具有安全性高和患者依从性好等优点。

由于赖脯胰岛素的生产工艺具有一定的技术壁垒,所以目前国内赖脯胰岛素主要由甘李、礼来和江苏万邦生化等少数厂家获批上市。目前,各企业多采用重组大肠杆菌工程菌发酵表达包涵体,在通过变复性处理的路线生产赖脯胰岛素。

目前,可采用重组基因工程菌表达目的蛋白的方式制备胰岛素。表达系统包括原核基因表达系统、酵母表达系统和动物细胞表达系统。对于原核基因表达系统,使用最多的即为大肠杆菌Escherichiacoli来作为宿主菌,这也是目前应用最广泛的蛋白表达系统。原因是大肠杆菌表达系统遗传背景和生理特性研究清楚,已开发有多种商业化工程菌可以使用;且大肠杆菌易于培养和控制、转化操作简单,并具有表达水平高、成本低、周期短等特点。对于应用原核系统表达外源基因时,大多研究利用融合蛋白表达方式,将各种不同的引导肽序列融合到目的基因上,形成重组融合蛋白。在大肠杆菌中表达时,引导肽可以将目的蛋白分泌到细胞周质甚至细胞外,最后,通过蛋白酶等将引导肽切除去。

然而,由于胰岛素结构的特殊性(双链结构、多对分子内二硫键等),目前赖脯胰岛素前体在表达过程中普遍存在表达水平低的技术缺陷。

因此,仍迫切需要开发能够高效表达赖脯胰岛素前体的重组基因工程菌,以提高发酵效率,有效降低生产成本,进而得到价格低、质量高的赖脯胰岛素,进而满足国内需求,降低患者的经济负担。

发明内容

为了解决上述技术问题,本发明提供了一种赖脯胰岛素前体,其重组基因工程菌及其构建方法。

概念:

赖脯胰岛素:其结构上的特点是将人胰岛素β链28、29位的脯氨酸(Pro)、赖氨酸(Lys)次序对换,其中A7(Cys)-B7(Cys)、A20(Cys)-B19(Cys)四个半胱氨酸中的巯基形成两个二硫键,使赖脯胰岛素A链、赖脯胰岛素B链连接起来,同时存在一对A链内二硫键A6(Cys)-A11(Cys)。

赖脯胰岛素多肽:是指赖脯胰岛素的单链氨基酸肽段,具体是指赖脯胰岛素B链和赖脯胰胰岛素A链通过连接肽(如C肽)相连获得的多肽。赖脯胰岛素B链氨基酸序列为:FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTKPT(SEQ ID No:15);赖脯胰岛素A链氨基酸序列为GIVEQCCTSICSLYQLENYCN(SEQ ID No:16)。

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