[发明专利]中华甲虫蒲螨寄生对草地贪夜蛾基因的转录组分析方法

说明书

本发明提供了中华甲虫蒲螨寄生对草地贪夜蛾基因的转录组分析方法，本发明涉及生物技术领域，对草地贪夜蛾进行蒲螨寄生对照实验，利用转录组学技术对蒲螨寄生草地贪夜蛾5龄幼虫组与草地贪夜蛾5龄幼虫未被寄生组的差异表达基因进行了比较分析，挖掘出了草地贪夜蛾被中华甲虫蒲螨寄生后与免疫相关的基因，加深了草地贪夜蛾参与寄生胁迫的免疫响应途径的认识，为高效利用中华甲虫蒲螨防控草地贪夜蛾提供了理论依据。为证明转录组测序结果的可靠性，通过qRT‑PCR分别验证了15个免疫差异表达基因的相对表达趋势，结果有12个免疫基因与转录组测序数据基本一致，说明转录组测序数据可靠。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体为中华甲虫蒲螨寄生对草地贪夜蛾基因的转录组分析方法。

背景技术

中华甲虫蒲螨Pyemotes zhonghuajiachong(Yu and Zhang)是我国本土特有的一种优势外寄生性螨，能寄生鳞翅目、鞘翅目和同翅目等群居和隐蔽性害虫，被称为“蛀虫杀手”,是中国的优良天敌资源。蒲螨胎生且个体微小,体长仅200-350μm，具有繁殖快、毒力强、雌雄比极高和容易饲养等特点。蒲螨偏好寄生寄主节间膜处，通过叮咬将蛰针刺入寄主表皮，向寄主体内注射特异性蛋白神经毒素进行永久性麻痹，后以寄主血淋巴为食，蒲螨含有对寄主昆虫高毒而对哺乳动物安全的神经毒素,该毒素注射到寄主体内使其产生不可逆麻痹即死亡。1只300ng的蒲螨寄生30min可麻痹致死6-7mg重的白蚁；单头蒲螨只需叮咬合欢巢蛾幼虫15min就能将其麻痹；仅3头中华甲虫蒲螨寄生48h 能100％致死草地贪夜蛾1-3龄幼虫，40头蒲螨寄生48h能100％致死草地贪夜蛾1-5龄幼虫和预蛹、致死60％卵和40％蛹。综上所述，蒲螨是一类具有广阔应用前景的生防资源；草地贪夜蛾Spodopterafrugiperda(J E Smith)属鳞翅目Lepidoptera、夜蛾科Noctuidae、灰翅蛾属Spodoptera，也被称为秋粘虫Fall armyworm(FAW)，是一种原产于美洲热带和亚热带地区的害虫。中华甲虫蒲螨作为一种本土优势的昆虫天敌，是草地贪夜蛾的一种有效的寄生性天敌，前期研究发现，中华甲虫蒲螨能寄生致死草地贪夜蛾的卵、幼虫、蛹和成虫，但是关于中华甲虫铺满对草地贪夜蛾寄生免疫抑制及调控的研究很少。

发明内容

针对上述存在的技术不足，本发明的目的是深入挖掘中华甲虫蒲螨寄生对草地贪夜蛾免疫相关的基因，以期为高效利用中华甲虫蒲螨防控草地贪夜蛾提供理论依据。

为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：

中华甲虫蒲螨寄生对草地贪夜蛾基因的转录组分析方法，具体分析方法如下：

1)设立实验A组、实验B组和对照组草地贪夜蛾，使用毛笔刷挑10头中华甲虫蒲螨寄生于实验A组中的草地贪夜蛾体表，使用毛笔刷挑40头中华甲虫蒲螨寄生于实验B组中的草地贪夜蛾体表，对照组内的草地贪夜蛾不予寄生处理，24h后分别对实验A组、实验B组和对照组内的草地贪夜蛾进行取样。

2)提取步骤1内实验A组、实验B组和对照组内的草地贪夜蛾的RNA；构建cDNA文库；

3)对构建的cDNA文库进行质量控制并上机测序；

4)Illumina高通量测序得到的原始图像数据文件经CASAVA碱基识别 (BaseCalling)分析转化为原始测序序列(Sequenced Reads)，我们称之为Raw Data或RawReads；

5)原始测序序列里面含有带接头的、低质量的reads，为了保证后续分析的质量，需要去除接头序列，过滤掉低质(Low Quality，碱基质量值小于等于 25的碱基数占整个reads 60％以上)和N(N表示无法确定碱基信息)比例大于5％的reads，获得可用于后续分析的clean reads；

6)利用Trinity软件对clean reads进行拼接以获取后续分析的参考序列；