[发明专利]基于RNAi干扰核盘菌OAH基因的重组载体及其构建方法与应用

权利要求书

1.一种重组载体pCAMBIA1301-D35s-SsOAH-NOS在制备抗菌核病油菜材料中的应用，其特征在于，所述重组载体包含干扰核盘菌OAH基因的核苷酸序列，所述核盘菌OAH基因的序列如SEQ ID NO:1所示；所述重组载体通过以下方法制备：

根据核盘菌OAH序列信息，选择核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示序列作为干涉片段；

设计序列如SEQ ID NO.3~4所示的干涉片段引物OAH-sF和OAH-ovlapsR，利用DNA聚合酶扩增，和中间link序列片段进行扩增，PCR扩增程序为94℃预变性5min；94℃ 30sec，56℃30sec，68℃40sec，32个循环；68℃延伸5min，25℃1min；

再将正向干涉片段与中间link序列使用序列如SEQ ID NO.5~6所示的引物OAH-asF和OAH-asR通过PCR重叠延伸技术连接到一起，PCR重叠延伸，反应程序同上，但延伸为45sec；

然后利用琼脂糖凝胶电泳回收目的片段，连接目的片段与T载体，且所述连接体系为：4.5μL目的片段，0.5μLpMD-18T载体，5μLSolutionⅠ；

通过热激发将连接产物转化，将干涉片段克隆至pEasy-Blunt载体并转化到大肠杆菌DH5α中，菌液涂于含Amp抗生素的LB固体平板上，生长10-12h小时后，挑选单克隆，做菌液PCR检测，得到阳性的正向干涉克隆载体-和反向干涉克隆载体；

选择KpnI与SpeI酶切位点双酶切pCAMBIA1301载体质粒，胶回收线性载体质粒；KpnI与SalI酶切Ri02s-W载体，SalI与SpeI双酶切Ri02as后均通过TA回收相应的外源片段，与回收的线性载体质粒利用T4DNA连接酶连接产物，电转化到大肠杆菌感受态细胞中；挑取克隆子，利用SEQ ID NO.7~8所示引物做菌液PCR检测确定阳性克隆子，得到的PCR产物长度约700bp，从而获得干扰载体pCAMBIA1301-D35s-SsOAH-NOS。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述重组载体用于干扰核盘菌草酸的积累。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的应用方法包括：

将得到的重组载体转入农杆菌GV3101，以农杆菌侵染法转化甘蓝型油菜，采用PCR鉴定出转基因株系；

通过qPCR鉴定Ss.OAH表达水平；

培育SS.OAH.RNAi的转基因株系。

4.一种提高油菜对菌核病抗性的方法，其特征在于，所述方法包括在油菜中导入包含核盘菌致病基因OAH干扰片段的重组载体，其中，所述基因OAH的核苷酸序列如SEQIDNO:1所示，所述重组载体为权利要求1中所述的pCAMBIA1301-D35s-SsOAH-NOS。