[发明专利]一种位点可控和有序交联双酶聚集体的制备方法及应用

权利要求书

1.一种位点可控和有序交联双酶聚集体的制备方法，其特征在于包括下述步骤：首先，用醛酮还原酶AKR和乙醇脱氢酶ADH作为模型酶蛋白，通过两种非天然氨基酸对叠氮基-L-苯丙氨酸和对炔丙氧基-L-苯丙氨酸分子修饰，得到的双酶突变体，即AKR-对叠氮基-L-苯丙氨酸突变体和ADH-对炔丙氧基-L-苯丙氨酸突变体；然后，细胞裂解后，混合双酶上清液，在微波辐射辅助下，在细胞裂解上清混合液中直接进行共价交联，完成定点有序交联，得到双酶聚集体。

2.根据权利要求1所述位点可控和有序交联双酶聚集体的制备方法，其特征在于：分别选取远离AKR和ADH活性中心的四个位点，得到了两种不同空间距离的AKR两点突变体和ADH两点突变体。

3.根据权利要求1所述位点可控和有序交联双酶聚集体的制备方法，其特征在于：醛酮还原酶AKR与乙醇脱氢酶ADH的摩尔比为1：1。

4.根据权利要求1所述位点可控和有序交联双酶聚集体的制备方法，其特征在于：细胞裂解上清混合液中的蛋白质浓度为15mg·mL^-1～25mg·mL^-1。

5.根据权利要求1所述位点可控和有序交联双酶聚集体的制备方法，其特征在于：双酶交联反应时，细胞裂解上清混合液中加入0.4个当量的CuI。

6.根据权利要求2所述位点可控和有序交联双酶聚集体的制备方法，其特征在于：醛酮还原酶两点突变体分别为AKR-138Q-215E、AKR-49Y-266E；乙醇脱氢酶两点突变体分别为ADH-4Y-252E、ADH-156Y-190Y。

7.根据权利要求1所述位点可控和有序交联双酶聚集体的制备方法，其特征在于：微波温度为15℃，微波功率为12W，微波时间为4～5min。

8.根据权利要求1所述位点可控和有序交联双酶聚集体的制备方法，其特征在于具体包括下述步骤：

(1)使大肠杆菌MG1655成为诱导醛酮还原酶AKR和乙醇脱氢酶ADH表达的宿主，将构建好的ADH和ADH突变体菌株接种到LB培养基中，培养基中抗生素及其浓度为氨苄青霉素50μg·mL-1，氯霉素34μg·mL-1和卡那霉素100μg·mL-1；并在振荡培养箱中34℃，220rpm培养生长；当菌液OD600达到0.6时，添加诱导剂L-Arabinose至终浓度为0.2％；在OD600为0.8时，添加诱导剂aTc至终浓度为30ng·mL^-1，并同时加入非天然氨基酸至终浓度为1mM；放入振荡培养箱中23℃，200rpm诱导酶蛋白表达，诱导时间为16h；

(2)诱导结束后，以离心获得的细胞沉淀，离心的转数为8000rpm，时间为5min，并用PBS缓冲液洗涤沉淀；沉淀重悬于PBS中并通过超声处理裂解细胞，其中PBS加入量为原菌液体积的1/5，超声破碎采用冰浴，功率400W，破碎时间10min，其中每10s设置破碎3s停7s；细胞破碎后的可溶性和不溶性部分通过离心分离得到细胞破碎液上清，离心的转数为10000rpm，时间为15min；

(3)细胞裂解后，混合双酶上清液，得到双酶上清混合液；将0.4个当量的CuI加入双酶上清混合液中；将装有上述混合物的容器放入配有冷却模块的微波反应器中，并在15℃和12W的功率下照射4min；

(4)分离酶蛋白组装体，使用离心的方法，离心的转数为12000xg，时间为10min，并用PBS洗涤，并使用Bradford法进行检测直到上清液中未检测到蛋白质；

(5)将得到的双酶聚集体通过蛋白标记后，用CLSM来表征和确定其形貌；或在30℃真空干燥箱中过夜干燥，最后得到的干燥的双酶聚集体通过SEM来表征和确定其形貌。

9.一种权利要求1所述方法得到的双酶聚集体在级联催化中合成氯丙那林中间体(R)-1-(2-氯苯基)乙醇的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于具体催化合成的过程如下：用突变体AKR-49-266-pAzF和ADH-156-190-p-PaF制得的双酶聚集体投入到反应体系中；反应体系为：酶蛋白1mg，2-氯苯基乙酮2mg，NADP⁺10mg，异丙醇300μL，加PBS至2mL；反应均在30℃下进行，磁力搅拌12h；反应结束后，将酶蛋白从反应混合物中离心分离；用5mL正己烷萃取反应混合物，上清液用高效液相色谱法进行分析，Daicel IC色谱柱进行色谱分离；正己烷与异丙醇的体积比为96：4；泵的流速为1mL/min，柱温保持在20℃，进样量为10μL；在波长210nm处采集数据，用相应标准品的保留时间验证底物和目标产物，并根据标准曲线计算产率和异构体的比例。