[发明专利]一种CTLA4基因人源化动物模型的构建方法及应用

说明书

本发明提供一种CTLA4基因人源化动物模型的构建方法及应用。基于CRISPR/Cas9技术，本发明通过筛选对靶基因切割活性高的gRNA，提供一种高效构建可稳定传代的CTLA4基因人源化动物模型，特别是小鼠模型的方法。采用的方案是将人CTLA4基因对应蛋白的编码区插入到动物Ctla4基因转录本第1号外显子的翻译起始位点，并取代动物内源的翻译起始位点，获得CTLA4基因人源化动物模型。本发明的方法获得的CTLA4人源化动物阳性率高，阳性动物可检测到人源CTLA4蛋白的活跃的表达，给予识别人CTLA4的抗体，可实现非常显著的肿瘤抑制效果。

技术领域

本发明涉及动物基因工程和基因遗传修饰生物技术领域，具体涉及人源化基因修饰动物模型的构建方法及应用，特别是涉及CTLA4基因人源化基因改造非人动物模型的构建方法及其在生物医药领域的应用。

背景技术

通过阻断人体抗肿瘤反应的抑制信号来增强患者对肿瘤的免疫应答被认为是当前最有希望的新型癌症免疫疗法。CTLA4和PD-1被认为是免疫系统的两个重要的检查点(Checkpoint)，它们对T细胞的免疫反应起着负向调控作用。通过阻断人体抗肿瘤反应的抑制信号来增强患者对肿瘤的免疫应答被认为是当前最有希望的新型癌症免疫疗法。CTLA4和PD-1被认为是免疫系统的两个重要的检查点(Checkpoint)，它们对T细胞的免疫反应起着负向调控作用。

CTLA4细胞毒性T细胞相关蛋白4(Cytotoxic T lymphocyte associate protein4)，是T细胞表面表达的一类共刺激分子(co-stimulatory molecule)。其与CD28的功能类似，在T细胞激活过程中，CTLA4能够与抗原递呈细胞表面的CD80/CD86特异性结合来激活下游信号。CTLA4分子高表达于调节性T淋巴细胞(Treg)和激活的T淋巴细胞上。正常情况下，T淋巴细胞的活化需要两条信号通路共同激活，一是T细胞受体(TCR)与抗原呈递细胞(APC)呈递的MHC-抗原肽复合物相结合，二是CD80/CD86与T细胞表面的共刺激分子CD28相结合。T细胞活化后，诱导CTLA4高表达，虽然与CD28具有高度同源性，但功能相反，即CTLA4分子与B7分子结合后抑制T细胞的活化。

2011年，美国FDA批准首款抗CTLA4的抗体抑制剂Ipilimumab(商品名)用于治疗不能手术切除的晚期黑色素瘤，并在2015年10月份批准其作为辅助治疗药物用于III期黑色素瘤患者。尽管该药在临床试验阶段显示出较好的总生存率，并与对照组相比有明显的临床疗效提升，但YERVOY在临床应用时，常见有皮疹、腹泻、疲劳、瘙痒、头痛、体重下降和恶心等副作用。YERVOY还能在消化系统、肝脏、皮肤、神经系统及产生激素的腺体内引起自体免疫性疾病。对于YERVOY的作用机理，目前认为其并不是通过阻断CTLA4/B7相互作用而发挥抗肿瘤效果，而上通过清除Fc受体介导的高表达CTLA4的肿瘤局部调节性T细胞(Treg)发挥抗肿瘤效果。

目前全球范围内以CTLA4为靶点的药物，仅百时美施贵宝的Yervoy上市，该药2021年也获批在中国上市。其他在CTLA4单抗领域研发进度较快的还有阿斯利康的Tremelimumab与信达生物的IBI-310，均在临床3期试验阶段。另外还有百时美施贵宝的三款CTLA4单抗都处于临床2期阶段。中国药企研发进度较快的是和铂生物，目前一款CTLA4单抗也正在进行临床2期试验。在以CTLA4为靶点的双抗领域，中国康方生物的PD-1、CTLA4双抗产品已经在2021年9月在国内申请上市，有望成为国内首个上市的PD-1/CTLA4双特异性抗体；康宁杰瑞的PD-1/CTLA4双抗产品也已完成三期临床试验。