[发明专利]一种精氨酸突变的DNA/RNA连接酶

说明书

本发明涉及一种精氨酸突变的DNA/RNA连接酶，其包含与现有技术的Hyperligase(SEQ ID NO:1)的氨基酸序列相比，为选自79位具有突变的氨基酸序列。本发明还涉及编码所述酶的核酸分子、包含所述核酸分子的载体，以及包含所述核酸分子或所述载体的重组细胞。此外，本申请还涉及包含所述酶的组合物以及所述酶的用途。

本发明是以下发明的分案申请：申请日：2021.07.01；申请号：202110754255.7；发明名称《核酸连接酶》。

技术领域

本发明涉及生物技术领域。具体涉及基于现有技术的核酸连接酶进行突变而得到的新的核酸连接酶。本发明还涉及包含所述酶的产品。

背景技术

核酸连接酶是一种金属离子依赖性酶，催化DNA或RNA相邻的3’末端与5’末端之间形成磷酸二酯键，实现底物样品的分子内环化或分子间线性连接反应。核酸连接酶根据催化底物的不同可分为DNA连接酶和RNA连接酶。部分连接酶可催化DNA与RNA之间的连接反应^[1,2]。根据物种来源的不同，天然的核酸连接酶具有多种独特的特性，如底物特异性、序列偏好性、热稳定性、耐盐、耐pH变化等。

一般认为，完整的核酸连接反应分为三个阶段进行^[1]。第一阶段，连接酶与ATP或NAD⁺的腺苷基团结合，将ATP或NAD⁺中的腺苷基团转移至酶的保守基序中的赖氨酸残基，释放出焦磷酸盐，并形成酶和腺苷的中间体。该步骤是一种平衡反应，能够双向进行。在第二阶段，酶和腺苷的中间体将其腺苷基团转移至核酸底物的5’磷酸末端，形成5’腺苷酰化的中间产物。该步骤也是一种平衡反向，能够双向进行。第三阶段，酶的赖氨酸催化位点与核酸的3’羟基末端结合，攻击核酸的5’腺苷酰化末端，催化二者之间形成磷酸二酯键，完成连接反应。常见的连接酶一般以5’磷酸化的核酸为底物，催化连接反应完整的三个阶段，实现连接反应^[3,4]。

连接酶是分子克隆技术、高通量测序文库制备、基因合成和分子诊断等常用分子生物学方法的基础，在分子生物学研究和分子诊断技术中占据重要地位^[5,6]。按照酶的反应温度的不同，可将连接酶分为热稳定型和非热稳定型两类。目前，用于双链DNA或RNA连接反应的连接酶较多，但用于单链DNA连接反应的酶仅有极其有限的选择，能够在较高温度下(如65℃)进行单链连接的热稳定连接酶更少。

目前已经有几种热稳定单链核酸连接酶报道。热稳定TS2126连接酶(商品名为CircLigase)能够直接在65℃催化5’磷酸末端与3’羟基末端之间的连接反应^[7]，但催化具有末端序列偏好性，导致底物的选择性连接^[7]，造成结果的偏差。基因突变后的Mth RNA热稳定连接酶(商品名为Thermostable 5′AppDNARNA Ligase)同样能够在较高温度下催化单链核酸之间的连接反应，但其用于单链DNA连接反应时连接效率较低^[8]。另一种能够在较高温度下催化单链DNA之间连接反应的酶Taq DNA连接酶虽然具有较高的连接效率，但需要以互补链为模板作为引导，无法单独用于单链核酸的连接反应。