[发明专利]一种酶法制备糖基化甜菊糖苷类化合物的方法及其衍生物

说明书

本发明公开了一种酶法糖基化甜菊糖苷类化合物方法及其衍生物，在糖基转移酶存在下，将葡萄糖基供体的糖基转移到甜菊糖苷类化合物的C19连接的第一个葡萄糖基的C‑6’上和/或将葡萄糖基供体的糖基转移到甜菊糖苷类化合物的C19连接的第一个葡萄糖基的C‑2’上。糖基化衍生物与相应底物比较，甜味增加、苦味减少，提升了口感品质，是潜在的优质甜味剂，可用作食品中的天然甜味剂、膳食补充剂及药品成分等。该方法是目前酶法优化甜菊糖苷类化合物其甜味剂品质实验中产量高，效果好，方法操作简单，产品副产物极少，绿色环保无污染，生产成本低，适合于工业生产。

技术领域

本发明属于生物催化转化技术领域，涉及一种糖基转移酶对甜菊糖苷类化合物进行糖基化的方法及其衍生物和应用。

背景技术

甜菊糖苷是从菊科植物甜叶菊的叶子中提取出来的一种糖苷，它具有高甜度、低热能的特点，是天然的甜味剂。其化学结构为一种二萜类化合物，以二萜类甜菊醇为基本骨架^[1]。甜菊糖苷主要存在于甜叶菊叶片中，其叶片中含有甜茶苷(Rub)、甜菊苷(St)、莱鲍迪苷A(RA)、莱鲍迪苷B(RB)、莱鲍迪苷D(RD)、莱鲍迪苷E(RE)、莱鲍迪苷M(RM)等。除了高甜度低热量的优势，甜菊糖甙被认为具有重要的药理学生物活性，如抗氧化，抗菌，抗真菌，抗病毒，抗肿瘤、利尿、保胃(止泻)作用，能止痛，免疫调节作用，降血压、血糖，抑制肿瘤生长，促进细胞再生，以及强化血管^[2]。使用甜菊糖甙作为甜味剂对肥胖症，糖尿病(II型)，高血压，心脑血管疾病，低血糖，龋齿等有辅助治疗作用^[2-3]。因此，甜菊糖苷类化合物不仅作为甜味剂在食品工业中添加，还作为辅助治疗剂在保健药品中使用^[6]。尽管甜菊糖苷产业处于蓬勃发展中，但口感中的苦涩余味对阻碍其的商业应用^[4]。

大量的文献报道增加苷元上携带的β-葡萄糖的数量可以增强甜菊糖苷类化合物的甜度并改善口感降低苦味^[5]。或者延长C19(R1)上的β-葡萄糖，同样可以减弱苦涩味。目前常用的酶法修饰为对甜菊糖苷类化合物进行糖基化，一般采用环糊精糖基转移酶和UDP-糖基转移酶。前者低区域选择性导致产物混乱，需要配合特定的糖苷酶进行部分糖苷水解才能得到专一产物，这增加了操作难度，生产成本也较高；而后者高区域选择性，获取产物纯度高，副产物减少操作流程，降低生产成本。

UDP-糖基转移酶在糖基化时一般固定催化某一类型的糖苷键，比如UGT76G1催化1，3-β-D-glycosidic糖苷键，而UGTSL2催化1，2-β-D-glycosidic糖苷键。但两者不仅催化C19糖基化，也催化C13糖基化，降低延长C19位的糖苷链的效率。此外UGTSL2在催化甜菊糖苷类化合物的1，2-β-D-glycosidic糖苷键的同时还伴有1，6-β-D-glycosidic糖苷键的副产物，导致产品纯度下降，增加提取产品难度，使工艺复杂化。

UDP-糖基转移酶在糖基化反应过程中不可缺少的是糖基供体，主要的糖基供体包括UDPG、UDP-半乳糖、UDP-葡萄糖醛酸等，其中应用最为广泛的就属UDPG，但UDPG价格高，不适用于在工业化生产中大规模应用。蔗糖合酶与糖基转移酶的偶联反应能够在糖基化反应中通过添加蔗糖来实现UDPG原位再生循环。利用蔗糖合酶与糖基转移酶建立双酶偶联体系，双酶催化时，首先由蔗糖合酶催化蔗糖裂解生成UDPG和果糖^[7]。随后由糖基转移酶催化进行糖基化反应。而糖基化过程中生成的UDP又可被蔗糖合酶利用，再次转化为UDPG，从而实现循环利用，同时也避免了UDP的积累对酶活性的抑制。采用双酶偶联体系，只需添加廉价的蔗糖作为底物，而不需昂贵的UDPG，因此可以达到控制生产成本的目的。