[发明专利]一种生产2′-岩藻糖基乳糖的乳酸乳球菌及其应用

说明书

本发明属于微生物代谢工程领域，涉及一种以食品级安全菌株乳酸乳球菌为研究对象，利用两种不同途径生产2′‑岩藻糖基乳糖的方法。本发明分别在乳酸乳球菌中利用从头合成途径和补救途径实现了合成2′‑FL的目的，证实了利用乳酸乳球菌生产2′‑FL的可行性。另外，本发明通过在发酵培养基中添加血红素，进一步增加了2'‑FL的产量，经过48h发酵后，通过从头合成途径，2′‑FL的产量可达0.66g/L。

技术领域：

本发明属于微生物代谢工程领域，涉及一种以食品级安全菌株乳酸乳球菌为研究对象，利用两种不同途径生产2′-岩藻糖基乳糖的方法。

背景技术：

母乳作为婴儿唯一的天然食物，支持着新生儿的健康成长发育。人乳寡糖是存在于母乳中的第三大类营养物质，其含量仅次于乳糖和脂肪，在婴幼儿的健康成长中起重要作用。HMOs(人乳寡糖)的结构非常多样化，目前已鉴定出的寡糖就有1000多种，其中2′-FL(2′-岩藻糖基乳糖)是一种占比最大的人乳低聚糖(HMOs)产品，可高达31％。人乳寡糖作为益生元，可以调节婴儿肠道菌群的组成，预防病原体粘附肠道、预防感染。调节新生儿的免疫系统，促进大脑发育。可以保护小肠黏膜结构、增强肠黏膜血流量，有效预防坏死性小肠结肠炎。因此在婴幼儿奶粉中添加食品级微生物生产的HMOs可以增强新生婴儿的免疫力、有效增强新生婴儿的体质，也可避免大肠杆菌生产的安全性问题。

目前2′-FL(2′-岩藻糖基乳糖)的合成多采用化学法、酶法和微生物全细胞合成法。化学合成过程复杂，产率低，容易产生有毒试剂，酶法合成需要多种酶的纯化，成本高，与前两种合成方法相比，利用微生物全细胞合成法合成2′-FL更加安全、快捷且成本低，是目前最有潜力能够实现大规模生产2′-FL的可行方法。利用大肠杆菌生产2′-岩藻糖基乳糖主要有两条代谢途径，分别是从头合成途径和补救途径，从头合成途径主要是在大肠杆菌原有糖代谢途径的基础上，构建以葡萄糖为原料的GDP-岩藻糖的从头合成途径，由胞内代谢物6-磷酸果糖开始，通过磷酸甘露糖异构酶(ManA)、磷酸甘露糖变位酶(ManB)，甘露糖-1-磷酸鸟嘌呤基转移酶(ManC)，GDP-甘露糖-6-脱氢酶(Gmd)和GDP-岩藻糖合成酶(WcaG)的顺序作用合成GDP-岩藻糖。进一步经过futC(α-(1,2)-岩藻糖基转移酶)的作用，以GDP-岩藻糖和乳糖为底物，合成2′-岩藻糖基乳糖。补救途径是经过岩藻糖1-激酶/GDP-岩藻糖焦磷酸化酶(Fkp)的作用，将岩藻糖转化为GDP-岩藻糖，进一步经过futC(α-(1,2)-岩藻糖基转移酶)的作用，以GDP-岩藻糖和乳糖为底物，合成2′-岩藻糖基乳糖。

除了研究最多的大肠杆菌，其它安全级工业微生物，例如酿酒酵母、谷氨酸棒杆菌、枯草芽孢杆菌等也已经被证实可用于生产2′-FL。

对于微生物合成2′-FL的宿主还主要侧重于大肠杆菌，可能是因为大肠杆菌自身拥有产磷酸核苷糖的有效途径、有效的乳糖吸收和2′-FL的输出途径。然而，没有证据表明大肠杆菌是大规模生产2′-FL的最佳生物。相比大肠杆菌，乳酸乳球菌L.lactis基因敲除、基因整合和遗传转化等方法相对复杂，但乳酸乳球菌耐酸性更强，能够微氧发酵，无法降解岩藻糖和乳糖，乳酸乳球菌作为可直接应用于乳制品中的食品安全级微生物，目前还没有用于合成2′-FL的报道。

发明内容：

为了解决上述技术问题，本发明通过遗传改造并借助于NICE食品级表达系统，建立高效的无痕敲除和安全无抗的筛选方法，在乳酸乳球菌中通过两种不同途径(图1)实现了对2′-FL(2′-岩藻糖基乳糖)的有效合成。

本发明提供的技术方案之一，是一种通过从头合成途径合成2′-FL的乳酸乳球菌重组菌株，所述重组菌株是在乳酸乳球菌宿主的基因组上整合磷酸甘露糖异构酶编码基因manA、磷酸甘露糖变位酶编码基因manB、GDP-甘露糖-4,6-脱水酶基因gmd和GDP-岩藻糖合成酶基因wcaG，同时通过质粒对甘露糖-1-磷酸鸟嘌呤基转移酶基因manC、α-(1,2)-岩藻糖基转移酶基因futC以及乳糖透过酶基因lacF进行表达；