[发明专利]一种乳源外泌体及提取方法

说明书

本发明涉及一种乳源外泌体的提取方法，依次按下述步骤进行：(1)将乳原料分装，离心，取清液；(2)将步骤(1)得到的清液离心，取中间层清液；(3)将步骤(2)得到的中间层清液离心，取清液，与PBS缓冲液和外泌体提取试剂混匀，孵育；(4)将步骤(3)的产物离心，保留沉淀，用PBS缓冲液重悬；(5)将步骤(4)的产物离心，取上清，即得。采用本发明提供的乳源外泌体提取方法制备的乳源外泌体，相较于其他方法制备的乳源外泌体而言，形态更完整，需要的样品体积更少，且在分离后包含的乳源外泌体的蛋白种类更多，更有利于分析研究作业。

技术领域

本发明涉及乳制品技术领域，特别是乳源外泌体及提取方法。

背景技术

外泌体是细胞主动分泌产生的双层膜结构圆形或椭圆形囊泡，直径在30-200nm，密度为1.13-1.19g/mL。1983年，首次在网织红细胞中转铁蛋白受体的研究中发现50nm的小囊泡。1987年，加拿大学者Rose Johnstone创造“Exosome”一词并认为外泌体只是细胞向外界环境“排泄”的工具。2007年，Valadi等提出外泌体包含mRNA和miRNA并可以将其传递给另一个细胞，至此外泌体的功能及其机制开始得到广泛研究。外泌体存在于各种体液环境中，如血清、尿液、唾液、乳汁、羊水等。生物体液中的外泌体表明其起源细胞的功能状态，在医学上可作为肝癌、前列腺癌等疾病的生物诊断标记物；由于外泌体的膜结构还可以作为药物载体表现出高效药物传递的特性，例如外泌体负载不稳定的姜黄素可提高治疗效果。

乳源外泌体是由乳腺上皮细胞分泌的小囊泡，其主要组成成分是蛋白质、脂质以及核酸。乳源外泌体膜表面具有特异性膜蛋白，如最丰富的四跨膜蛋白(CD9、CD82、CD81和CD63)，以及共刺激分子(CD54)和粘附分子(CD11b)。脂类(磷脂酰胆碱、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰乙醇胺、鞘磷脂和磷脂酰肌醇)也常见于外泌体中。乳源外泌体中核酸主要包括非编码单链RNA分子(micro RNA，mi RNA)、长链非编码RNA(long non-coding RNA，lnc RNA)、环状RNA(circular RNA，circ RNA)、m RNA和t RNA等。乳源外泌体在生理过程中发挥着重要功能，如介导细胞交流、促进细胞生长以及参与免疫反应等。

目前常用的外泌体分离技术是离心法，但是离心法会对外泌体的形态造成损伤。

因鉴于此，特提出此发明。

发明内容

为了解决现有的技术问题，本发明提供了一种新的乳源外泌体的提取方法，该提取方法对外泌体的形态影响较小。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

第一方面，本发明提供了一种乳源外泌体的提取方法，依次按下述步骤进行：

(1)将乳原料分装，离心，取清液；

(2)将步骤(1)得到的清液离心，取中间层清液；

(3)将步骤(2)得到的中间层清液离心，取清液，与PBS缓冲液和外泌体提取试剂混匀，孵育；

(4)将步骤(3)的产物离心，保留沉淀，用PBS缓冲液重悬；

(5)将步骤(4)的产物离心，取

优选或可选地，步骤(1)中的离心工艺为室温下1500-2500×g离心5-15min。

优选或可选地，步骤(2)中的离心工艺为室温下8500-10000×g离心25-35min，优选的，离心时间为30min。

优选或可选地，步骤(3)中的离心工艺为室温下8500-10000×g离心25-35min，优选的，离心时间为30min。

优选或可选地，步骤(3)中，清液、PBS缓冲液和外泌体提取试剂的体积比为1:1:1。