[发明专利]可提升2-KLG产量的L-山梨糖脱氢酶突变体

说明书

本发明公开了可提升2‑KLG产量的L‑山梨糖脱氢酶突变体，属于基因工程和酶工程技术领域。本发明以氧化葡萄糖酸杆菌来源的L‑山梨糖脱氢酶为出发序列，通过定点突变获得了可以提升2‑KLG产量的L‑山梨糖脱氢酶突变体。通过发酵检测，突变体V368C、V368L、V368S和V368T的2‑KLG产量分别达到2.5g/L、3.1g/L、2.5g/L和3.0g/L，分别为表野生型L‑山梨糖脱氢酶菌株的1.1、1.4、1.1和1.3倍。

技术领域

本发明涉及可提升2-KLG产量的L-山梨糖脱氢酶突变体，属于基因工程和酶工程技术领域。

背景技术

维生素C，又称抗坏血酸，是人体必须的一种维生素。广泛应用于食品、饮料、制药、化妆品和饲料领域。2-酮基-L-古龙酸(2-KLG)是生产维生素C的直接前体物质。目前工业生产2-KLG利用三菌两步发酵法。和一步发酵相比，三菌两步发酵法具有高能耗、高物耗、混菌发酵难以精确调控和育种困难等劣势。探索一步发酵生产2-KLG成为了研究者的共同目标。由于从山梨醇生产2-KLG只涉及3个酶的催化过程，分别为D-山梨醇脱氢酶、L-山梨糖脱氢酶和L-山梨酮脱氢酶。因此，目前研究者大多通过代谢工程进行一步菌的研究。主要方法是将2-KLG合成途径中关键酶基因进行异源表达进行2-KLG的生产，但效果并不能和工业化生产媲美。目前研究表明，L-山梨糖脱氢酶可能是2-KLG生产过程中的关键限速酶。NCBI比对显示，L-山梨糖脱氢酶属于葡萄糖-甲醇-胆碱氧化还原酶家族。这类酶包含两个结构域，N末端结构域属于辅因子结合域，C末端结构域属于底物结合域。目前针对L-山梨糖脱氢酶改造的研究较少，对L-山梨糖脱氢酶进行有效的改造，有可能提升2-KLG的生产强度。

发明内容

发明人前期通过筛选获得了一株可以直接将D-山梨醇转化为2-酮基-L-古龙酸(2-KLG)的氧化葡萄糖酸杆菌(Gluconobacter oxydans)WSH-004，并鉴定了其中的L-山梨糖脱氢酶与L-山梨酮脱氢酶。本发明通过基因工程和酶工程的手段，制备出了可以提升2-KLG产量的L-山梨糖脱氢酶突变体。

本发明提供了可以提升2-KLG产量的L-山梨糖脱氢酶突变体，以来源于氧化葡萄糖酸杆菌(Gluconobacter oxydans)WSH-004的L-山梨糖脱氢酶为出发序列，将第368位缬氨酸突变为半胱氨酸、亮氨酸、丝氨酸或苏氨酸。

在一种实施方式中，所述出发序列的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

在一种实施方式中，所述突变体是将第368位置的缬氨酸(Val)变成半胱氨酸(Cys)，突变体命名为V368C，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

在一种实施方式中，所述突变体是将第368位置的缬氨酸(Val)变成亮氨酸(Leu)，突变体命名为V368L，其氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。

在一种实施方式中，所述突变体是将第368位置的缬氨酸(Val)变成丝氨酸(Ser)，突变体命名为V368S，其氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。

在一种实施方式中，所述突变体是将第368位置的缬氨酸(Val)变成苏氨酸(Thr)，突变体命名为V368T，其氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。

本发明还提供了编码所述突变体的基因。

在一种实施方式中，编码突变体V368C的核苷酸序列是在SEQ ID NO.6的基础上将第368位密码子由GUG替换为UGC。

在一种实施方式中，编码突变体V368L的核苷酸序列是在SEQ ID NO.6的基础上将第368位密码子由GUG替换为CUU。

在一种实施方式中，编码突变体V368S的核苷酸序列是在SEQ ID NO.6的基础上将第368位密码子由GUG替换为UCG。