[发明专利]一种测序小环形DNA分子的方法

说明书

本发明提供了一种测序小环形DNA分子的方法，包括包括：构建重组转座子片段；富集小环形DNA分子；构建重组小环形DNA分子；验证阳性克隆载体。利用转座子将抗生素抗性基因随机插入到各个小环形DNA分子之中，使得每个重组小环形DNA分子中均至少获得一段抗生素抗性基因，而由于后续培养过程中的培养基添加了相关的抗生素，所以只有成功转化有重组小环形DNA分子的克隆载体才能够在培养基中存活和繁殖，使得所述抗生素抗性基因成为重组小环形DNA分子的“保守序列”，从而能够针对该抗生素抗性基因设计相应的PCR扩增，再于分析小环形DNA分子序列的时候使用软件将抗生素抗性基因序列剔除。

技术领域

本发明涉及基因检测技术领域，特别涉及一种测序小环形DNA分子的方法。

背景技术

在藻类二次内共生的进化过程中，甲藻的叶绿体基因组由传统的包括100-250个基因的100-200kbp大小的单个大环形DNA分子进化成特异性的包括0-2个基因的0.4-10kbp大小的多个小环形DNA分子。这个变化可能是由于叶绿体基因组的分裂或重组。过去一般根据小环形DNA分子的保守序列设计引物，然后采用PCR扩增来分析小环形DNA分子的序列，但是这种方法容易遗漏一些没有保守序列的小环形DNA分子，因此不能测序出甲藻所有的小环形DNA分子；通过PCR扩增和后续的测序、拼接等分析很难获得小环形DNA分子的完整信息。

发明内容

本发明目的在于提供一种测序小环形DNA分子的方法，以解决现有技术中所存在的一个或多个技术问题，提供至少一种有益的选择或创造条件。

本发明的第一方面在于提供了一种测序小环形DNA分子的方法，其步骤包括：

构建重组转座子片段：将抗生素抗性基因插入转座子，得到重组转座子片段，备用；

富集小环形DNA分子：将待含有小环形DNA分子的目标细胞裂解，通过凝胶电泳收集长度为0.4-10kbp的小环形DNA分子；

构建重组小环形DNA分子：通过酶切，将备用的重组转座子片段插入富集所得的小环形DNA分子中，经纯化，获得重组小环形DNA分子；

验证阳性克隆载体：将构建所得的重组小环形DNA分子转化至克隆载体中，经过含有抗生素的培养基筛选，获得具有抗生素抗性基因的阳性菌株，提取阳性菌株的质粒，以所述抗生素抗性基因作为保守序列设计引物，进行测序分析。

前述提供的测序小环形DNA分子的方法是通过向最初富集所得的小环形DNA分子插入抗生素抗性基因，并将带有抗生素抗性基因的重组小环形DNA分子转化至克隆载体中，使得克隆载体获得了在含有对应抗生素的培养基中存活和繁殖的能力，并使得抗生素抗性基因成为了重组小环形DNA分子的“保守序列”，从而能够针对该抗生素抗性基因设计相应的PCR扩增来分析小环形DNA分子的序列。

进一步，含有小环形DNA分子的所述目标细胞为甲藻。

进一步，所述富集是离心收集培养五周的甲藻前环藻Amphidinium carterae细胞，通过碱裂解所述甲藻，并通过电泳获取0.4-10kbp的产物。通过凝胶电泳，能够准确获得长时间培养的甲藻中长度范围为0.4-10kbp的小环形DNA分子，便于后续利用转座子进行抗生素抗性基因的插入处理。

进一步，所述抗生素抗性基选自卡那霉素抗性基因、博来霉素抗性基因、新霉素磷酸转移酶抗性基因、潮霉素抗性基因、巴龙霉素抗性基因、红霉素抗性基因、氨基苄青霉素抗性基因或四环素抗性基因中的至少一种。