[发明专利]一种大叶金腰SSR分子标记引物组合及应用

权利要求书

1.一种大叶金腰SSR分子标记引物组合，其特征在于：所述SSR分子标记包括cpSSR2、cpSSR5、cpSSR11、cpSSR12、cpSSR23五组，其核苷酸序列如SEQ ID NO.11～15所示；

所述引物组合包括：

扩增分子标记cpSSR2的引物，正向及反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1～2所示；

扩增分子标记cpSSR5的引物，正向及反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3～4所示；

扩增分子标记cpSSR11的引物，正向及反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.5～6所示；

扩增分子标记cpSSR12的引物，正向及反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.7～8所示；

扩增分子标记cpSSR23的引物，正向及反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.9～10所示。

2.权利要求1中所述大叶金腰SSR分子标记引物组合在大叶金腰种群遗传多样性分析中的应用。

3.根据权利要求2所述的大叶金腰SSR分子标记引物组合在大叶金腰种群遗传多样性分析中的应用，其特征在于：具体步骤如下：

(1)基因组DNA提取：采用改良CTAB法提取大叶金腰高质量总基因组DNA，DNA质量和浓度采用紫外分光光度核酸测定仪测定，并用1％的琼脂糖凝胶电泳检测确认；

(2)PCR反应体系：对应配制五组，每一组反应体系总体积为10μL，包含2×T5 SuperPCR Mix(PAGE)5μL、10μmol·L^-1正反向引物各0.4μL，总基因组DNA 1μL，ddH₂O 3.2μL；

PCR反应程序为：98℃预变性2min；98℃变性10s，58℃退火10s，72℃延伸10s，共35个循环；72℃总延伸2min后4℃保存；

(3)电泳检测：采用4％聚丙烯酰胺凝胶电泳对扩增产物进行分离，电泳缓冲液为1×TBE，90W恒压电泳1.5～2.0h，银染检测引物的多态性，拍照采集电泳图像；

(4)数据分析：根据电泳图像，采用人工读带的方法，将图上可重复的、易分辨的条带记为“1”，同一位置无带计为“0”，并将数据输入Excel建立原始“01”数据矩阵；

利用NTSYS软件计算遗传相似系数，并采用非加权配对算术平均法UPGMA进行遗传相似性聚类分析；

运用GENDIVE version3.06软件，计算等位基因数Na、有效等位基因数Ne、观测杂合度Ho和期望杂合度He等多样性指标。

4.权利要求1中所述大叶金腰SSR分子标记引物组合的获取方法，其特征在于：获取方法包括以下步骤：

(1)大叶金腰叶绿体基因组序列获取及cpSSR位点鉴别

从GenBank公共数据库中下载大叶金腰叶绿体基因组序列MK973001，利用MISA perl脚本软件搜索叶绿体基因组中分布的SSR位点，获得初筛cpSSR分子标记的核苷酸序列；检索标准为：单核苷酸、二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸和六核苷酸重复类型的最少重复次数分别设置10、6、5、5、5和5次；

(2)cpSSR引物设计

利用Primer 3软件对上步骤中初筛cpSSR分子标记的核苷酸序列进行引物设计，引物设计原则为：GC含量40～60％，退火温度57～60℃，引物长度18～23bp，预计扩增产物长度100～300bp；获得初筛cpSSR引物的核苷酸序列；

(3)cpSSR引物二次筛选

先采用改良CTAB法提取大叶金腰高质量总基因组DNA，然后以此为模板，对上步骤中的初筛cpSSR引物均构建PCR反应体系，进行PCR反应，PCR扩增结束后，采用凝胶电泳对扩增产物进行分离，银染检测引物的多态性，拍照采集电泳图像；选取其中稳定性好、多态性高、清晰度高的电泳条带所对应的引物，即得到所述的大叶金腰SSR分子标记引物组合。