[发明专利]斑马鱼心脏发育相关基因簇缺失突变体中主效基因的筛选方法和应用

说明书

本发明公开了斑马鱼心脏发育相关基因簇缺失突变体中主效基因的筛选方法和应用，包括确定斑马鱼hoxbb基因簇中hoxb1b、hoxb5b、hoxb6b和hoxb8b基因的靶点位置并分别设计靶点gRNA序列和引物进行PCR扩增，体外转录获得gRNA与Cas9mRNA显微注射到斑马鱼中，有突变的斑马鱼与野生型杂交得杂合子F₁，性成熟的F₁交配得纯合突变体，对基因敲除的后代显微成像和单基因鉴定初步筛选具有明显表型的基因hoxb1b，单细胞测序数据分析hoxbb中四个单基因早期表达情况和原位杂交、基因敲低与过表达筛选出与心脏早期发育相关的主效基因hoxb1b，有助于寻找致病靶点和药物筛选。

技术领域

本发明属于分子生物学领域，具体涉及斑马鱼心脏发育相关基因簇缺失突变体中主效基因的筛选方法和应用。

背景技术

CRISPR/Cas技术是继ZFIN及TELEN后近几年比较火热的基因编辑系统，基于其具有简单、高效、易操作等优势已经在全球多种模式生物中得到广泛应用。研究初期主要发现两个CRISPR/Cas9作用系统：I型和III型。随着科学技术的进步与发展，来自加州大学伯克利分校和奥摩大学的两位博士与2012年合作发现了一种Ⅱ型的CRISPR/Cas9系统。这个系统构成简单，仅仅需要两端的RNA以及Cas9的核酸内切酶就可以行使对靶位点的切割功能。后来，来自麻省理工的张峰和哈佛医学院的George Church两个实验室同时将Cas9系统作用于人类的细胞中并产生有效切割作用。随后CRISPR/Cas9在全世界的实验室相继展开并且成功地在各个模式动物中应用开来。由CRISPR/Cas9介导的基因敲除工作已经涉及到从细菌到鱼类再到灵长类。这一过程对各层生物进化阶段的物种进行定点敲除，为研究生物体基因功能及生物进化提供行之有效的技术手段，CRISPR/Cas成为开发基因编辑构建疾病模型的有效工具。

生物在基因组进化和适应环境的过程中，一些基因会形成一类串联重复基因，形成了基因簇。在动植物中及微生物中，串联重复事件的发生给生物基因组带来基因拷贝数的增加和等位基因的变异。对于复杂的功能串联重复序列-串联重复基因的研究，可以揭示生物的重要性状及表型相关的基因/基因家族的形成机制或演化规律。近年来常用的研究方法是通过表型观察、遗传学、代谢组、转录组和重测序等方法，确定特定性状产生的关键组分和遗传规律，之后通过定位和克隆关键候选基因，最后确定出关键基因。以上的方法耗费时间较长，价格比较昂贵。本专利中发明的通过CRISPR技术构建突变体，并通过表型的观察和分子生物学的验证筛选主效基因的方法高效快捷，可操作性强。

Hox基因是一类在早期胚胎发育过程中调控身体形态构建的转录因子家族。当Hox基因发生突变时，往往会导致早期胚胎发育的畸形。Hox基因在进化过程中发生了全基因组的加倍，最先发现的果蝇中只含有一个Hox基因簇，小鼠等四足动物中发生了两次全基因组的加倍，形成4个Hox基因簇，斑马鱼等大多数硬骨鱼发生了额外一次的基因组加倍，形成了7个hox基因簇，共48个基因成员。目前关于Hox基因功能的研究主要是其在动物躯体形态的构建中的作用，但部分Hox基因在器官发育中也发挥重要作用，例如Hox10在肠及肾脏的发育过程中发挥一定作用，Hoxb1在哺乳动物中显示出心脏异常发育的现象，有研究报道Hox基因在第二心域(SHF)前体细胞或神经嵴细胞(NCC)中表达。2014年Steven E Weicksel等人研究hoxb1b和hoxb1a，发现他们共同调控后脑菱脑节的发育。而在小鼠中，对Hoxb1的研究主要是其对咽弓的调控作用，并且影响心脏SHF及OFT的发育。2008年Joshua S.Waxman等人在斑马鱼中通过敲降hoxb5b研究其功能。但Hox基因调控心脏前体细胞发育的机制尚不清楚。