[发明专利]一种NMD荧光报告载体系统及其构建方法与应用

权利要求书

1.一种pcNMD荧光载体系统，其特征在于，包含pcNMD-EGFP荧光报告载体和pcNMD-mCherry荧光报告载体，所述pcNMD-EGFP荧光报告载体和pcNMD-mCherry荧光报告载体是由载体pcMINI改造而成，所述pcNMD-EGFP荧光报告载体和pcNMD-mCherry荧光报告载体包含CMV增强子、pCMV启动子、外显子A-内含子A基因片段、多克隆位点1、pcNMD-EGFP或pcNMD-mCherry、多克隆位点2和含正常终止密码子的内含子B-外显子B基因片段，pcNMD-EGFP用于表达PTC突变型基因序列，pcNMD-mCherry用于表达未突变的野生型基因序列，所述多克隆位点1和多克隆位点2用于在荧光基因前后插入PTC突变附近的编码序列。

2.根据权利要求1所述一种NMD荧光报告载体系统及其构建方法与应用，其特征在于：所述多克隆位点1位于荧光蛋白编码基因上游，用于插入PTC突变5’侧的部分基因编码序列；所述多克隆位点2位于荧光蛋白编码基因下游，用于插入包含PTC突变位点、PTC突变3’侧部分序列及基因正常终止密码子的基因序列。

3.权利要求1～2任一项所述的pcNMD载体的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1、以商品化真核表达载体pEGFP-C1为模板，设计扩增引物，经PCR扩增获得绿色荧光蛋白EGFP的编码DNA片段，然后经EcoRI/EcoRV双酶切插入载体pcMINI多克隆位点区域，获得重组载体pcNMD-EGFP；

S2、以商品化真核表达载体pmCherry-N1为模板，设计扩增引物，经PCR扩增获得红色荧光蛋白mCherry的编码DNA片段，然后经EcoRI/EcoRV双酶切后插入载体pcMINI多克隆位点区域，获得pcNMD-mCherry重组载体；

S3、将步骤S1和S2中得到的pcNMD-EGFP重组载体和pcNMD-mCherry重组载体分别转化至大肠杆菌DH5α感受态细菌，培养后提取重组质粒，即为pcNMD-EGFP和pcNMD-mCherry载体。

4.如权利要求3所述的pcNMD-EGFP载体的构建方法，其特征在于，步骤S1中，PCR扩增绿色荧光蛋白EGFP编码DNA片段的引物为EGFP-EcoRI-F和EGFP-EcoRV-R，其序列分别如SEQID NO :1和SEQ ID NO:2所示。

5.如权利要求3所述的pcNMD-mCherry载体的构建方法，其特征在于，步骤S2中，PCR扩增红色荧光蛋白mCherry的编码DNA片段的引物为mCherry-EcoRI-F和mCherry-EcoRV-R，其序列分别如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示。

6.根据权利要求3所述的pcNMD-EGFP和pcNMD-mCherry载体的构建方法，其特征在于：步骤S3中具体方法如下：将得到的pcNMD-EGFP和pcNMD-mCherry重组载体通过热激法转化至大肠杆菌DH5α感受态细菌，并通过氨苄青霉素抗性筛选获得阳性重组质粒。

7.根据权利要求6所述的阳性重组质粒的筛选方法，其特征在于：具体方法如下：挑取单菌落接种于含氨苄青霉素的LB液体培养基中，在37℃、200rpm的条件下培养过夜，使用商品化质粒小提试剂盒提取重组pcNMD-EGFP和pcNMD-mCherry载体质粒DNA。

8.权利要求1～2任一项所述的pcNMD-EGFP和pcNMD-mCherry载体在体外验证真核生物无义介导的mRNA降解中的应用。

9.根据权利要求8所述的pcNMD-EGFP和pcNMD-mCherry载体在体外验证真核生物无义介导的mRNA降解中的应用，其特征在于，所述应用方法包括如下步骤：

S101、将突变位点5’侧的基因序列插入pcNMD-EGFP和pcNMD-mCherry载体的多克隆位点1区域；然后将含有突变位点及正常终止密码子的野生型DNA片段和突变型DNA片段插入pcNMD-EGFP和pcNMD-mCherry载体的多克隆位点2区域，构建表达野生型和突变型基因的NMD重组表达载体；

S102、将步骤S101中构建的野生型和突变型基因的重组NMD表达载体转染真核细胞，转染24小时后收集细胞；

S103、使用荧光显微镜或者流式细胞仪检测步骤S102中得到的转染野生型和突变型NMD重组表达载体的细胞，分析野生型和突变型细胞中EGFP绿色荧光和mCherry红色荧光结果，分析突变的影响。