[发明专利]一种细胞自噬监测探针及其制备方法

权利要求书

1.一种细胞自噬监测探针，其特征在于，包括能够对细胞自噬过程进行追踪的母体、能够提高监测灵敏度和选择性的供电子基团、能够快速筛查自噬体内毒性物质的定位基团以及渗透性高的游离探测基团；

所述母体由2-羟基-1-萘甲醛和2-氨甲基吡啶为原料合成的一种追踪体，且供电子基团由甲基丙烯酰胺、三乙胺和荧光素合成一种溶酶体，所述定位基团由胰蛋白酶、二氯甲烷、盐酸阿霉素和格列苯脲合成的一种筛查体，且游离探测基团由吡啶-2-甲酸酯、无水哌啶、冰醋酸和无水乙腈合成的一种可视体。

2.根据权利要求1所述的一种细胞自噬监测探针的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1：制备母体：将2-羟基-1-萘甲醛和2-氨甲基吡啶的混合溶液加入到甲醇溶液中回流反应3h-4h，冷却至室温，旋干，加少量氯仿和乙醚，析出固体，抽滤得到淡黄色母体并对其进行光谱测定；

S2：制备供电子基团：将物质的量相等的羧基荧光素和三乙胺加人到20mL-35mL的二氯甲烷中，置于冰水浴中冷却至0℃，将物质的量相等的甲基丙烯酰氯溶解在15mL-35mL的二氯甲烷中缓慢滴加到上述溶液中，搅拌一段时间后取出，于室温下反应一段时间后去除溶剂，用硅胶色谱柱层析纯化，溶剂为氯仿一甲醇，得到橙色供电子基团固体并将其进行聚合反应；

S3：制备定位基团：将胰蛋白酶、二氯甲烷、盐酸阿霉素和格列苯脲的混合溶液用95％乙醇加热回流提取，然后萃取和洗脱；

S4：制备游离探测基团：在100mL的两颈烧瓶中加入8mL吡啶-2-甲酸酯、5mL无水哌啶、1mL冰醋酸和50mL无水乙腈，在氩气的保护下，使用分水器加热至沸，反应过程用薄层色谱监测至化合物全部消失，反应结束后冷却至室温得到反应液。

S5：得到细胞自噬监测探针：将S1、S2、S3和S4中制得的产物加入史莱克瓶中，在无水无氧条件下加入30mL-45mL的N-二甲基甲酰胺，室温下搅拌反应24h，反应结束后先向反应液中加入50mL二氯甲烷将反应物溶解，再用30mL-50mL水萃取，收集有机相，通过柱层析出200-300目硅胶，得到目标产物。

3.根据权利要求2所述的一种细胞自噬监测探针的制备方法，其特征在于，所述S1中光谱测定包括以下步骤：

S101：将母体溶于二甲基亚砜(DMSO)溶剂中，制得3moL/L-10moL/L的母体储备液，配制15moL/L-25moL/L的金属离子储备液，将金属铝离子储备液与母体储备液混合搅拌成检测液；

S102：取一定量的检测液于比色管中，加入一定量的六次甲基四胺和HCL缓冲溶液，按1：1：1的溶剂定容至5mLu，放置5min-10min后进行光谱的测定。

4.根据权利要求2所述的一种细胞自噬监测探针的制备方法，其特征在于，所述S1中2-羟基-1-萘甲醛的浓度需控制在80％-90％，2-氨甲基吡啶的浓度需控制在60％-75％，且加入比例为2：3。

5.根据权利要求2所述的一种细胞自噬监测探针的制备方法，其特征在于，所述S2中聚合反应包括以下步骤：

S201：将FMA和HPMA以物质的量之比1：10溶解在1mL的DMS中并通过引发剂AIBN进行自由基聚合反应；

S202：抽真空充氮气置换5次，最后充10min的氮气，置于55℃的水浴锅中反应24h；

S203：反应结束后将产物在丙酮溶液中沉淀，滤出沉淀物后用乙醇洗涤，继续过滤沉淀物后再次用丙酮洗涤，随后用水溶解产物，离心沉降，得到具有荧光性质的水溶性高分子黄色聚合物。

6.根据权利要求2所述的一种细胞自噬监测探针的制备方法，其特征在于，所述S2中搅拌的时间需要控制在1h-1.5h，且室温下反应的时间需要控制在6h-8h。

7.根据权利要求2所述的一种细胞自噬监测探针的制备方法，其特征在于，所述S3中萃取和洗脱的具体方式为：通过加入石油醚、二氯甲烷和乙酸乙酯萃取，萃取后药渣用纯净水加热回流提取，然后用大孔吸附树脂纯化，最后依次用水、30％乙醇、60％乙醇和95％乙醇洗脱。