[发明专利]L-山梨糖脱氢酶突变体及其应用

说明书

本发明公开了L‑山梨糖脱氢酶突变体及其应用，属于基因工程和酶工程技术领域。本发明以氧化葡萄糖酸杆菌来源的L‑山梨糖脱氢酶为出发序列，通过定点突变获得了可以提升2‑KLG产量的L‑山梨糖脱氢酶突变体。表达突变体的重组菌株RS‑V368A、RS‑V336I‑V368A、RS‑V336L‑V368A和RS‑V336M‑V368A发酵72小时后2‑KLG的产量达4.01g/L、4.92g/L、3.84g/L和3.53g/L。

技术领域

本发明涉及L-山梨糖脱氢酶突变体及其应用，属于基因工程和酶工程技术领域。

背景技术

维生素C，又称抗坏血酸，是人体必须的一种维生素。广泛应用于食品、饮料、制药、化妆品和饲料领域。2-酮基-L-古龙酸(2-KLG)是生产维生素C的直接前体物质，一步发酵生产2-KLG是一个长期的目标。目前一步发酵生产2-KLG主要以代谢工程改造为主。而通过酶工程改造提升2-KLG合成途径中关键酶活性，进而提升2-KLG产量的研究较少。以D-山梨醇为底物进行2-KLG生产是目前较为主流的一步发酵方法。在这个途径中，D-山梨醇首先通过D-山梨醇脱氢酶生成L-山梨糖，随后L-山梨糖脱氢酶(SDH)催化L-山梨糖生成L-山梨酮，最后L-山梨酮脱氢酶催化L-山梨酮生成2-KLG。研究表明，D-山梨醇到L-山梨糖的转化率高达98％，而在实际发酵过程中重组菌株只能转化少部分L-山梨糖。所以，SDH的催化能力被认为是关键限速步骤。但是目前针对SDH改造的研究较少，对SDH进行有效的改造，有可能提升2-KLG的生产强度。

发明内容

氧化葡萄糖酸杆菌(Gluconobacter oxydans)WSH-004来源的L-山梨糖脱氢酶(SDH)进行了突变，制备出了可以提升2-KLG产量的SDH突变体。

本发明提供了L-山梨糖脱氢酶突变体，以来源于氧化葡萄糖酸杆菌(Gluconobacter oxydans)WSH-004的L-山梨糖脱氢酶为出发序列，将第368位缬氨酸突变为丙氨酸，和/或将第336位缬氨酸突变为异亮氨酸、亮氨酸或甲硫氨酸。

在一种实施方式中，所述出发序列的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

在一种实施方式中，所述突变体是将第368位置的缬氨酸(Val)变丙氨酸(Ala)，突变体命名为V368A，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

在一种实施方式中，所述突变体是将第336位置的缬氨酸(Val)变成异亮氨酸(Ile)，突变体命名为V336I。

在一种实施方式中，所述突变体是将第336位置的缬氨酸(Val)变成亮氨酸(Leu)，突变体命名为V336L。

在一种实施方式中，所述突变体是将第336位置的缬氨酸(Val)变成甲硫氨酸(Met)，突变体命名为V336M。

在一种实施方式中，所述突变体是将第336位置的缬氨酸(Val)变成异亮氨酸(Ile)，并将第368位置的缬氨酸(Val)变丙氨酸(Ala)，突变体命名为V336I-V368A，氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。

在一种实施方式中，所述突变体是将第336位置的缬氨酸(Val)变成亮氨酸(Leu)，并将第368位置的缬氨酸(Val)变丙氨酸(Ala)，突变体命名为V336L-V368A，氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。

在一种实施方式中，所述突变体是将第336位置的缬氨酸(Val)变成甲硫氨酸(Met)，并将第368位置的缬氨酸(Val)变丙氨酸(Ala)，突变体命名为V336M-V368A，氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。

本发明还提供了编码所述L-山梨糖脱氢酶突变体的基因。

在一种实施方式中，编码突变体V368A的核苷酸序列是在SEQ ID NO.6的基础上将第368位密码子由GUG替换为GCU，获得基因序列SEQ ID NO.7。