[发明专利]原发性膜性肾病诊断试剂盒的研发与应用

说明书

本发明公开了原发性膜性肾病诊断试剂盒的研发与应用，诊断试剂盒由诊断玻片(携带有Pla2r和Thsd7a过表达质粒的293T细胞玻片)、洗涤液、工作液、抗体孵育液等试剂耗材组成。本发明基于CBA方法，体外构建脱髓鞘疾病诊断而种血清学标志物(Pla2r和Thsd7a)质粒，转染胎肾上皮293细胞，组合表达不同标志物的细胞，以患者血清为靶的，通过细胞免疫荧光染色技术，实现对脱髓鞘疾病的联合诊断；产品具有灵敏性高(80.2％‑91.0％)、特异性强(100％)、经济性好、检测方法简单高效等优点；同时该产品通过对不同标志物联合检测，可实现对PMN疾病的快速诊断及疾病分类；有助于PMN疾病的早期筛查、诊断、预后评估、及临床用药。

技术领域

本发明涉及基因药物研发技术领域，尤其涉及原发性膜性肾病诊断试剂盒的研发与应用。

背景技术

原发性模性肾病(Primary Membranous nephropathy,PMN)是肾病综合征中常见的病理类型之一，病理表现为免疫复合物在肾脏组织内大量沉积以及补体增高引起的蛋白尿，是导致成年人肾病综合征的常见肾小球疾病。国外报道显示，PMN占成年人原发性肾病综合征病例的20％-40％。近年来，我国肾病的疾病谱发生明显变化，MN的发病率呈快速上升趋势，PMN的发病率由1997-2007年的15％上升至2014年的30-40％。PMN具有与其他肾脏疾病(PMN)相似的临床特征，且病理标志物呈多样性；容易造成误诊进一步导致治疗无效性。因此研发简单高效的PMN疾病诊断方法具有十分重要的临床意义。

肾脏活检学是PMN常用的诊断方法，病理学能分析病灶数量和大小，但无法实现疾病的亚型分类及早期诊断，且存在潜在安全风险、检测费用昂贵、取材不便等问题；且无法实现疾病亚型分类。近年来研究显示PMN病人血清Pla2r和Thsd7a自身抗体表达水平与疾病呈显著的相关性。针对1551例PMN患者的Meta分析显示，抗Pla2r血清自身抗体检测对于PMN的敏感性接近70％，特异性达到95％以上。2014年的研究发现抗Pla2r抗体阴性的PMN患者血清中存在Thsd7a，从而实现Pla2r和Thsd7a两项自身抗体对PMN的联合诊断效果。血清学IgG抗体检测具有经济、高效、检测便捷等优点，是肾脏活检学诊断有效的替代方法。。

但是常见的血清学Ig(G)抗体检测包括放射免疫沉淀法(RIPA)、间接细胞免疫荧光法(IFA)、酶联免疫吸附法(Elisa)等，但这些方法在临床使用中存在特异性差(Elisa)、检测效率低(IFA)以及安全隐患(RIPA)、灵敏度低等问题。

发明内容

1.要解决的技术问题

本发明的目的是为了解决现有方法在临床使用中存在特异性差(Elisa)、检测效率低(IFA)以及安全隐患(RIPA)、灵敏度低的问题，而提出的原发性膜性肾病诊断试剂盒的研发与应用。

2.技术方案

为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：

原发性膜性肾病诊断试剂盒，包括诊断玻片、洗涤液、工作液和抗体孵育液。

优选地，所述诊断玻片为携带有Pla2r和Thsd7a过表达质粒的293T细胞玻片。

本发明还提出了原发性膜性肾病诊断试剂盒的研发，包括以下步骤：

步骤1：Pla2r和Thsd7a表达质粒的构建及质粒提取，通过常规分子生物学方法构建Pla2r和Thsd7a过表达质粒；

步骤2：Pla2r和Thsd7a表达质粒转染293T细胞，常规方法培养HEK293T细胞，将pDC315-Pla2r-Flag和pDC315-Thsd7a-Flag过表达质粒连同Lipofactamine3000形成转染复合物，转染293T细胞；于转染后24、36、以及48小时固定细胞，Flag抗体免疫荧光染色，荧光显微镜下通过Flag表达比率确定转染效率；并通过荧光定量PCR和Westernblot验证表达强度；