[发明专利]一种检验大熊猫怀孕早期的分子方法

权利要求书

1.一种检验大熊猫怀孕早期的分子方法，其特征在于，利用怀孕大熊猫和未怀孕大熊猫之间显著差异表达的先天性免疫和适应性免疫基因作为Markers，通过实时荧光定量PCR，对待测样品中的Markers进行定量检测。

2.根据权利要求1所述检验大熊猫怀孕早期的分子方法，其特征在于，PCR扩增用到的专用引物：

Marker1：正向引物 5’- TGGTGCCGAACCAGTACAAC -3’

反向引物 5’- CCGAGCTCACGCCGAG -3’；

Marker2：正向引物 5’- TGGGAGACTCAGACGAGGATG -3’

反向引物 5’-AGCGTGACCGTGATGATGTT-3’；

Marker3：正向引物 5’- TGCTTGCGATGGGAGTTT -3’

反向引物 5’- ACCGTTGACAGGAAGTTTGA -3’；

Marker4：正向引物 5’- ACAGCACCCTCTGGTTCCC -3’

反向引物 5’- GCTCCTCTACCTTCAGTCGCTTA -3’。

3.根据权利要求1所述检验大熊猫怀孕早期的分子方法，其特征在于，实时荧光定量PCR扩增的内参基因的引物为：

正向引物 5’-GGTATGACAACGAATTTGGCTACA-3’

反向引物 5’-GATGGAAACAGTGGAGGTCAGGA-3’。

4.根据权利要求1所述检验大熊猫怀孕早期的分子方法，其特征在于，包括以下步骤：

A、取待测怀孕大熊猫的血液组织样本与未配种怀孕大熊猫组的血液组织样本，分离出外周血单核细胞；

B、提取总RNA,再将提取的RNA反转录为cDNA;

C、然后向cDNA中添加qPCR Mix、专用引物、去离子水配置成qPCR反应体系，qPCR反应使用荧光PCR操作平台；

D、使用2^−∆∆Ct方法计算每个Marker基因的表达水平；

E、基于T检验获得未怀孕大熊猫组每个Marker基因的2^−∆∆Ct置信区间；

F、将待测怀孕大熊猫个体的每个基因的2^−∆∆Ct值，与未怀孕大熊猫组每个Marker基因表达的置信区间进行比较，若均大于置信区间的上限值，则认为大熊猫怀孕。

5.根据权利要求4所述检验大熊猫怀孕早期的分子方法，其特征在于，所述样本的2^−∆∆Ct的计算方法为：

D1、每个样本按步骤B和C进行三次，用平均值测定待测Marker基因相对于内参基因的表达量ΔCt；

D2、计算每个样品中待测Marker基因的2^−∆Ct值；

D3、计算未怀孕大熊猫组的2^−∆Ct的均值，用2^−∆Ct值/未怀孕组2^−∆Ct均值，得到每个样本的2^−∆∆Ct值。