[发明专利]腺相关病毒在构建贲门失弛缓症动物模型中的应用

说明书

本发明提供腺相关病毒在构建贲门失弛缓症动物模型中的应用，腺相关病毒为pAAV‑CAG‑EGFP‑P2A‑Cre‑WPRE病毒和pAAV2‑retro‑hSyn‑DIO‑hM3D(Gq)‑mCherry病毒；选取SPF级雌性SD大鼠，将SD大鼠随机分为两组，第一组为假手术组，假手术组SD大鼠在下食管括约肌注射生理盐水；第二组为造模组，造模组SD大鼠禁食24小时后，麻醉并经其腹部上中切口暴露食管胃连接处，将pAAV‑CAG‑EGFP‑P2A‑Cre‑WPRE病毒和pAAV2‑retro‑hSyn‑DIO‑hM3D(Gq)‑mCherry病毒按1:1混合后，采用5μl Hamilton于连接处管壁垂直进针，在下食管括约肌四个象限进行位点注射，每个位点注射混合液各2μl；两组SD大鼠均在一个月后给予DCZ注射。表达hM3D(Gq)的病毒转染下食管括约肌迷走神经元，腹腔注射去氯氯氮平激活受体，成功诱导下食管括约肌肌张力增加，建立贲门失弛缓症动物模型。该模型具有精准、可控、可逆的特点。

技术领域

本发明涉及生物医学领域，具体涉及腺相关病毒在构建贲门失弛缓症动物模型中的应用。

背景技术

贲门失弛缓症症(AC)是一种以下食管括约肌不能松弛为主要特征的食管动力障碍性疾病，患病率为0.5-1.2/10万，占食管疾病的2％-20％，高峰期在30-60岁之间，男女发病率相似。患者主要表现为吞咽困难，呕吐，反流，胸痛以及体重减轻，严重影响患者生活质量。目前，贲门失弛缓症发病机制不明，临床上对于贲门失弛缓症常采用球囊扩张或者食管环形肌切开等方法机械性分离过于兴奋的下食管括约肌，但疗效不佳，是临床实践中的难点。通过建立与贲门失弛缓症发病机制类似的动物模型，对该疾病的临床和基础研究有重要的指导意义。

AC的病理生理特点是调控LES的迷走神经传出纤维支配的兴奋性和抑制性神经元失衡，伴随抑制性神经递质血管活性肠肽(VIP)或一氧化氮(NO)的下调，引起的食管下端括约肌(LES)无法松弛。目前，贲门失弛缓症的动物模型的建立方法主要采用缝合结扎的机械性梗阻方法或者下食管括约肌环周注射苄基二甲基十四烷氯化铵(BAC)造模，但现有的构建方法不能模拟病理生理机制，对于神经元的损伤和破坏没有选择性，大鼠死亡率高，造模成功率和稳定性难以保证。

发明内容

化学遗传技术具有选择性精准调控神经元的功能。本发明通过将化学遗传兴奋性受体腺相关病毒感染至迷走神经背核神经元，通过迷走神经传出纤维调控下食管括约肌，经腹腔注射化学遗传配体DCZ即可激活化学遗传受体，有效地长时程控制迷走神经的活动，具有高效、可逆、特异性地兴奋迷走神经元的功能，从而实现刺激下食管括约肌持续性收缩的作用。

本发明针对现有技术中的不足，提供腺相关病毒在构建贲门失弛缓症动物模型中的应用。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

腺相关病毒在构建贲门失弛缓症动物模型中的应用，所述腺相关病毒为pAAV-CAG-EGFP-P2A-Cre-WPRE病毒和pAAV2-retro-hSyn-DIO-hM3D(Gq)-mCherry病毒；pAAV-CAG-EGFP-P2A-Cre-WPRE病毒购置于和元生物技术(上海)股份有限公司，产品编号为CN396，pAAV2-retro-hSyn-DIO-hM3D(Gq)-mCherry病毒购置于山东维真生物科技有限公司(济南)，产品编号为pAV202002。

为优化上述技术方案，采取的具体措施还包括：

进一步地，所述动物模型的构建载体是八周龄、体重为150-180g的SPF级雌性SD大鼠。

进一步地，SD大鼠的饲养条件为：温度24±2℃、湿度50％-70％，12小时间断照明。