[发明专利]一种重组大肠杆菌、制备方法及合成3,4-二羟基丁酸的方法

权利要求书

1.一种重组大肠杆菌Ⅱ，其特征在于：通过敲除大肠杆菌中的木糖异构酶基因xylA、2-酮酸醛缩酶基因yjhH、2-酮酸醛缩酶基因yagE和醇脱氢酶基因，过表达木糖脱氢酶基因和/或2-酮酸脱羧酶基因，过表达醛脱氢酶基因，当醛脱氢酶基因为醛脱氢酶基因pduP(L.b)和/或醛脱氢酶基因pduP(K.p)时，还需同时过表达硫解酶基因tesB，得到一种重组大肠杆菌Ⅰ；

所述醇脱氢酶基因为醇脱氢酶基因yqhD、醇脱氢酶基因adhP、醇脱氢酶基因adhE和醇脱氢酶基因fucO中的一种以上；

在所述重组大肠杆菌Ⅰ中进行过表达木糖酸脱水酶基因、敲除2-酮酸还原酶基因、敲除丙酮醛合酶基因、敲除葡萄糖特异性转运蛋白酶IICB^Glc基因ptsG和过表达NADH氧化酶基因中至少一种处理，得到所述的重组大肠杆菌Ⅱ；

所述木糖脱氢酶基因为木糖脱氢酶基因xylB；所述2-酮酸脱羧酶基因为2-酮酸脱羧酶基因mdlC；所述醛脱氢酶基因为醛脱氢酶基因feaB、醛脱氢酶基因aldB、醛脱氢酶基因puuC、醛脱氢酶基因ydcW、醛脱氢酶基因pduP(L.b)和醛脱氢酶基因pduP(K.p)中的一种以上，过表达载体为pDHC29；

所述木糖酸脱水酶基因为木糖酸脱水酶基因xylD和/或木糖酸脱水酶基因HVO_RS00180，过表达载体为pTrc99a；

所述2-酮酸还原酶基因为2-酮酸还原酶基因yiaE；

所述丙酮醛合酶基因为丙酮醛合酶基因mgsA；

所述NADH氧化酶基因为NADH氧化酶基因noxE，过表达载体为pDHC29；

所述敲除采用Red同源重组技术。

2.根据权利要求1所述的重组大肠杆菌Ⅱ，其特征在于：所述大肠杆菌为K12系列大肠杆菌。

3.根据权利要求2所述的重组大肠杆菌Ⅱ，其特征在于：所述大肠杆菌为K12系列大肠杆菌中的MG1655。

4.权利要求1～3任一项所述的重组大肠杆菌Ⅱ的制备方法，其特征在于：由如下步骤组成：

步骤一、制备木糖异构酶基因xylA敲除的重组大肠杆菌菌株A1

1.基因敲除所用的打靶片段DNA的制备

采用从耶鲁大学菌种保藏中心购买的木糖异构酶基因xylA缺陷型大肠杆菌菌株JW3537-1，提取其基因组为模板，采用PCR分别扩增含有同源臂的基因片段，凝胶电泳分离，获得打靶片段DNA；上游引物xylA-S的序列为核苷酸序列表中的SEQ ID No.1，下游引物xylA-AN的序列为核苷酸序列表中的SEQ ID No.2；

2.感受态细胞制备

将转入pKD46质粒的待敲除基因的大肠杆菌制成感受态细胞；

3.目的基因的敲除

将打靶片段DNA转入感受态细胞中，加入SOC培养基培养，然后在含有卡那霉素的LB固体培养基平板上培养，待长出单菌落之后利用聚合酶采用PCR进行验证，验证结果正确即为敲除成功，筛选得到基因敲除的重组大肠杆菌菌株A1；

4.卡那霉素抗性基因的去除

接种重组大肠杆菌菌株A1于含有卡那霉素的LB液体培养基中培养，再转接至新鲜LB培养基培养，然后制成感受态细胞，转入pCP20质粒，在含有氨苄青霉素的LB培养基平板上培养，挑取单菌落，在LB液体培养基培养后，在LB固体培养基培养；分别挑取LB固体培养基中长出的单菌落，转移至LB固体培养基、含卡那霉素的LB固体培养基和含氨苄青霉素的LB固体培养基中培养，若含卡那霉素的LB固体培养基和含氨苄青霉素的LB固体培养基都无菌生长，而LB固体培养基有菌生长，则该菌已成功去除卡那霉素抗性基因；

步骤二、制备木糖异构酶基因xylA和2-酮酸醛缩酶基因yjhH双敲除的重组大肠杆菌菌株A2

采用从耶鲁大学菌种保藏中心购买的2-酮酸醛缩酶基因yjhH缺陷型大肠杆菌菌株JW5775-2，上游引物yjhH-S的序列为核苷酸序列表中的SEQ ID No.3，下游引物yjhH-AN的序列为核苷酸序列表中的SEQ ID No.4，在重组大肠杆菌菌株A1的基础上敲除2-酮酸醛缩酶基因yjhH，制得木糖异构酶基因xylA和2-酮酸醛缩酶基因yjhH双敲除的重组大肠杆菌菌株A2；去除重组大肠杆菌菌株A2的卡那霉素抗性基因；

其余方法同步骤一；

步骤三、制备木糖异构酶基因xylA、2-酮酸醛缩酶基因yjhH和2-酮酸醛缩酶基因yagE三敲除的重组大肠杆菌菌株A3

采用从耶鲁大学菌种保藏中心购买的2-酮酸醛缩酶基因yagE缺陷型大肠杆菌菌株JW0261-2，上游引物yagE-的序列为核苷酸序列表中的SEQ ID No.5，下游引物yagE-AN的序列为核苷酸序列表中的SEQ ID No.6，在重组大肠杆菌菌株A2的基础上进一步敲除2-酮酸醛缩酶基因yagE，制备得到木糖异构酶基因xylA、2-酮酸醛缩酶基因yjhH和2-酮酸醛缩酶基因yagE三敲除的重组大肠杆菌菌株A3；去除重组大肠杆菌菌株A3的卡那霉素抗性基因；

其余方法同步骤一；

步骤四、制备木糖异构酶基因xylA、2-酮酸醛缩酶基因yjhH、2-酮酸醛缩酶基因yagE和醇脱氢酶基因敲除的重组大肠杆菌菌株B-X

所述醇脱氢酶基因为醇脱氢酶基因yqhD、醇脱氢酶基因adhP、醇脱氢酶基因adhE和醇脱氢酶基因fucO中的一种以上，采用从耶鲁大学菌种保藏中心购买的醇脱氢酶基因缺陷型大肠杆菌时打靶DNA片段供体菌株及其对应引物如表3所示，在重组大肠杆菌菌株A3的基础上进一步敲除所述醇脱氢酶基因，制备得到大肠杆菌菌株B-X，X代表一种大肠杆菌菌株，取值为正整数；

表3构建醇脱氢酶基因缺陷型大肠杆菌时打靶DNA片段供体菌株及对应引物

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其余方法步骤同步骤一；

步骤五、构建过表达木糖脱氢酶基因和/或2-酮酸脱羧酶基因的重组载体质粒及含有所述重组载体质粒的重组大肠杆菌菌株C-X

1.过表达一个基因

(1)将载体质粒pTrc99a采用限制性内切酶处理成线性化载体质粒，并采用琼脂糖凝胶电泳纯化；以含有一个木糖脱氢酶基因或一个2-酮酸脱羧酶基因的相应微生物菌种基因组为模板，用PCR扩增木糖脱氢酶基因或2-酮酸脱羧酶基因片段，PCR扩增所得的基因片段采用相应的限制性内切酶处理，并采用琼脂糖凝胶电泳纯化；

(2)用T4 DNA连接酶将PCR扩增的基因片段与线性化载体质粒连接，获得重组载体质粒pTRM-Y-X，Y表示质粒中含有的基因个数，取值为正整数，本步骤重组载体质粒为pTRM-1-X；

(3)将重组载体质粒pTRM-1-X转化入重组大肠杆菌菌株B-X的感受态细胞，筛选，测序验证正确，得到含有重组载体质粒pTRM-1-X的重组大肠杆菌菌株C-X；

2.共同过表达两个基因

(1)将步骤五1(1)构建的重组载体质粒pTRM-1-X，采用限制性内切酶处理成线性化载体质粒，并采用琼脂糖凝胶电泳纯化；将重组载体质粒pTRM-1-X中没有的另一个木糖脱氢酶基因或另一个2-酮酸脱羧酶基因，以其相应微生物菌种基因组为模板，用PCR扩增得到该基因片段，PCR扩增所得的基因片段采用相应的限制性内切酶处理，并采用琼脂糖凝胶电泳纯化；

(2)用T4 DNA连接酶将PCR扩增的基因片段与线性化载体质粒连接，获得重组载体质粒pTRM-2-X；

(3)将重组载体质粒pTRM-2-X转化入重组大肠杆菌菌株B-X的感受态细胞，筛选，测序验证正确，得到含有重组载体质粒pTRM-2-X的重组大肠杆菌菌株C-X；

共同过表达三个以上的基因时，方法与步骤五2类似；

其中，当过表达的基因为2-酮酸脱羧酶基因mdlC时：

限制性内切酶为Nco I和BamH I；以恶臭假单胞菌12633的基因组为模板，采用PCR扩增2-酮酸脱羧酶基因mdlC的基因片段，上游引物mdlC-S的序列为核苷酸序列表中的SEQ IDNo.15，下游引物mdlC-A的序列为核苷酸序列表中的SEQ ID No.16；

当过表达的基因为木糖脱氢酶基因xylB时：

限制性内切酶为BamHI和HindIII；以新月柄杆菌CB15基因组为模板，采用PCR方法扩增木糖脱氢酶基因xylB的基因片段，使用添加了RBS的上游引物xylB-的序列为核苷酸序列表中的SEQ ID No.17；下游引物xylB-AN的序列为核苷酸序列表中的SEQ ID No.18；

步骤六、构建过表达醛脱氢酶基因的重组载体质粒及含有所述重组载体质粒的重组大肠杆菌菌株D-X

1.过表达一个基因

(1)将载体质粒pDHC29采用限制性内切酶处理成线性化载体质粒，并采用琼脂糖凝胶电泳纯化；以含有一个醛脱氢酶基因的相应微生物菌种基因组为模板，用PCR扩增醛脱氢酶基因片段，PCR扩增所得的基因片段采用相应的限制性内切酶处理，并采用琼脂糖凝胶电泳纯化；

(2)用T4 DNA连接酶将PCR扩增的基因片段与线性化载体质粒连接，获得重组载体质粒PDH-Y-X，即PDH-1-X；

(3)将重组载体质粒PDH-1-X转化入重组大肠杆菌菌株C-X的感受态细胞，筛选，测序验证正确，得到含有重组载体质粒PDH-1-X的重组大肠杆菌菌株D-X；

2.共同过表达两个基因

(1)将步骤六1(1)构建的重组载体质粒PDH-1-X，采用限制性内切酶处理成线性化载体质粒，并采用琼脂糖凝胶电泳纯化；将重组载体质粒PDH-1-X中没有的另一个醛脱氢酶基因或硫解酶基因tesB，以其相应微生物菌种基因组为模板，用PCR扩增得到该基因片段，PCR扩增所得的基因片段采用相应的限制性内切酶处理，并采用琼脂糖凝胶电泳纯化；

(2)用T4 DNA连接酶将PCR扩增的基因片段与线性化载体质粒连接，获得重组载体质粒PDH-2-X；

(3)将重组载体质粒PDH-2-X转化入重组大肠杆菌菌株C-X的感受态细胞，筛选，测序验证正确，得到含有重组载体质粒PDH-2-X的重组大肠杆菌菌株D-X；

共同过表达三个以上的基因时，方法与步骤六2类似；

所述重组大肠杆菌菌株D-X为所述的一种重组大肠杆菌Ⅰ；

步骤七、构建过表达木糖酸脱水酶基因的重组质粒及含有所述重组质粒的重组大肠杆菌菌株

1.过表达一个基因

(1)将重组载体质粒pTRM-Y-X采用限制性内切酶处理成线性化载体质粒，并采用琼脂糖凝胶电泳纯化；以含有一个木糖酸脱水酶基因的相应微生物菌种基因组为模板，用PCR扩增木糖酸脱水酶基因片段，PCR扩增所得的基因片段采用相应的限制性内切酶处理，并采用琼脂糖凝胶电泳纯化；

(2)用T4 DNA连接酶将PCR扩增的基因片段与线性化载体质粒连接，获得重组载体质粒pTRMD-Y-X，即pTRMD-1-X；

(3)将重组载体质粒pTRMD-1-X转化进入重组大肠杆菌菌株B-X的感受态细胞，筛选，测序验证正确，得到含有重组载体质粒pTRMD-1-X的重组大肠杆菌菌株E-X；

2.共同过表达两个基因

(1)将步骤七1(1)构建的重组载体质粒pTRMD-1-X，采用限制性内切酶处理成线性化载体质粒，并采用琼脂糖凝胶电泳纯化；将重组载体质粒pTRMD-1-X中没有的另一个木糖酸脱水酶基因，以其相应微生物菌种基因组为模板，用PCR扩增得到该基因片段，PCR扩增所得的基因片段采用相应的限制性内切酶处理，并采用琼脂糖凝胶电泳纯化；

(2)用T4 DNA连接酶将PCR扩增的基因片段与线性化载体质粒连接，获得重组载体质粒pTRMD-2-X；

(3)将重组载体质粒pTRMD-2-X转化入大肠杆菌菌株B-X的感受态细胞，筛选，测序验证正确，得到含有重组载体质粒pTRMD-2-X的重组大肠杆菌菌株E-X；

共同过表达三个以上的基因时，方法与步骤七2类似；

步骤八、敲除重组大肠杆菌菌株中2-酮酸还原酶基因

1.在去除卡那霉素抗性基因的重组大肠杆菌菌株B-X中敲除2-酮酸还原酶基因，制备得到重组大肠杆菌菌株F-X；去除大肠杆菌菌株F-X的卡那霉素抗性基因；

当2-酮酸还原酶基因为2-酮酸还原酶基因yiaE时，采用从耶鲁大学菌种保藏中心购买的2-酮酸还原酶基因yiaE缺陷型大肠杆菌菌株JW5656，上游引物yiaE-S的序列为核苷酸序列表中的SEQ ID No.19，下游引物yiaE-AN的序列为核苷酸序列表中的SEQ ID No.20；其余方法同步骤一；

2.将步骤七制得的重组载体质粒pTRMD-Y-X转化进入重组大肠杆菌菌株F-X，得到含有重组载体质粒pTRMD-Y-X的重组大肠杆菌菌株F-X；

3.将步骤六制得的重组载体质粒pDH-Y-X转化进入含有重组载体质粒pTRMD-Y-X的重组大肠杆菌菌株F-X，得到重组大肠杆菌菌株G-X；

步骤九、敲除重组大肠杆菌菌株中丙酮醛合酶基因

1.在重组大肠杆菌菌株F-X中敲除丙酮醛合酶基因，制备得到重组大肠杆菌菌株H-X；

当丙酮醛合酶基因为丙酮醛合酶基因mgsA时，采用从耶鲁大学菌种保藏中心购买的丙酮醛合酶基因mgsA缺陷型大肠杆菌菌株JW5129-1，上游引物mgsA-S的序列为核苷酸序列表中的SEQ ID No.21，下游引物mgsA-AN的序列为核苷酸序列表中的SEQ ID No.22；其余方法同步骤一；

2.将步骤七制得的重组载体质粒pTRMD-Y-X转化进入重组大肠杆菌菌株H-X，得到含有重组载体质粒pTRMD-Y-X的重组大肠杆菌菌株H-X；

3.将步骤六制得的重组载体质粒pDH-Y-X转化进入含有重组载体质粒pTRMD-Y-X的重组大肠杆菌菌株H-X，得到重组大肠杆菌菌株I-X；

步骤十、敲除重组大肠杆菌菌株中的葡萄糖特异性转运蛋白酶IICB^Glc基因ptsG1.在重组大肠杆菌菌株F-X中敲除葡萄糖特异性转运蛋白酶IICB^Glc基因ptsG，制备得到重组大肠杆菌菌株J-X；

采用从耶鲁大学菌种保藏中心购买的葡萄糖特异性转运蛋白酶IICB^Glc基因ptsG缺陷型大肠杆菌菌株JW1087-2，上游引物ptsG-S的序列为核苷酸序列表中的SEQ ID No.23，下游引物ptsG-AN的序列为核苷酸序列表中的SEQ ID No.24；其余方法同步骤一；

2.将步骤七制得的重组载体质粒pTRMD-Y-X转化进入重组大肠杆菌菌株J-X，得到含有重组载体质粒pTRMD-Y-X的重组大肠杆菌菌株J-X；

3.将步骤六制得的重组载体质粒pDH-Y-X转化进入含有重组载体质粒pTRMD-Y-X的重组大肠杆菌菌株J-X，得到重组大肠杆菌菌株K-X；

步骤十一、构建过量表达NADH氧化酶基因的重组大肠杆菌

1.将步骤七制得的重组载体质粒pTRMD-Y-X分别转化进入重组大肠杆菌菌株H-X和重组大肠杆菌菌株J-X，得到含有重组载体质粒pTRMD-Y-X的重组大肠杆菌菌株H-X和含有重组载体质粒pTRMD-Y-X的重组大肠杆菌菌株J-X；

2.过表达一个基因

(1)将载体质粒pDH-Y-X采用限制性内切酶处理成线性化载体，用琼脂糖凝胶电泳纯化；以含有一个NADH氧化酶基因的相应微生物菌种基因组为模板，用PCR扩增NADH氧化酶基因片段，PCR扩增所得的基因片段采用相应的限制性内切酶处理，并采用琼脂糖凝胶电泳纯化；

(2)用T4 DNA连接酶将PCR扩增的基因片段与线性化载体质粒连接，获得重组载体质粒pDHN-Y-X，即pDHN-1-X；

(3)将重组载体质粒pDHN-1-X分别转化进入含有重组载体质粒pTRMD-Y-X的重组大肠杆菌菌株H-X的感受态细胞和含有重组载体质粒pTRMD-Y-X的重组大肠杆菌菌株J-X的感受态细胞，筛选，测序验证正确，得到含有重组载体质粒pDHN-1-X的重组大肠杆菌菌株L-X；

3.共同过表达两个基因

(1)将步骤十一1构建的重组载体质粒pDHN-1-X，采用限制性内切酶处理成线性化载体质粒，并采用琼脂糖凝胶电泳纯化；将重组载体质粒pDHN-1-X中没有的另一个NADH氧化酶基因，以其相应微生物菌种基因组为模板，用PCR扩增得到该基因片段，PCR扩增所得的基因片段采用相应的限制性内切酶处理，用琼脂糖凝胶电泳纯化；

(2)用T4 DNA连接酶将PCR扩增的基因片段与线性化载体质粒连接，获得重组载体质粒pDHN-2-X；

(3)将重组载体质粒pDHN-2-X分别转化进入含有重组载体质粒pTRMD-Y-X的重组大肠杆菌菌株H-X的感受态细胞和含有重组载体质粒pTRMD-Y-X的重组大肠杆菌菌株J-X的感受态细胞，筛选，测序验证正确，得到含有重组载体质粒pDHN-2-X的重组大肠杆菌菌株L-X；

共同过表达三个以上的基因时，方法与步骤十一3类似；

所述重组大肠杆菌菌株E-X、重组大肠杆菌菌株G-X、重组大肠杆菌菌株I-X、重组大肠杆菌菌株K-X和重组大肠杆菌菌株L-X为所述的一种重组大肠杆菌Ⅱ。