[发明专利]醋化醋杆菌及获取方法、复合冻干发酵剂的制备方法及其在制醋中的应用

权利要求书

1.一种醋化醋杆菌，其特征在于，该菌株为云南老仓醋优势菌醋化醋杆菌(Acetobacter aceti)，于2022年04月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.24700。

2.一种醋化醋杆菌的获取方法，其特征在于，所述获取步骤包括：

S1：采样，取云南老仓醋发酵池内醋化阶段13-25天醋液低温保藏；

S2：制备菌悬液：称取1g醋样品倒入15mL灭过菌的离心管中，加入9mL无菌水，振荡5～10min，使样品充分分散，即配制10^-1浓度的悬液；

S3：稀释：将1mL 10^-1悬液用无菌移液枪吸入含有9mL无菌水的离心管中，即为10^-2的样品稀释液，重复此过程可依次制成10^-3、10^-4、10^-5、10^-6的稀释液；

S4：使用酵母膏1％、葡萄糖1％、琼脂2％配制培养基，采用倾注法，在倾注前加入碳酸钙2％和无水乙醇4％，待平皿凝固后倒置于35℃恒温培养箱培养，72h后记录稀释倍数和相应的菌落数量；

S5：分离纯化，挑取醋化醋杆菌平板上典型的菌落，划线后30℃倒置培养72h，挑取单个菌落，进行菌落特征观察、革兰氏染色、显微镜细胞形态观察以及醋化醋杆菌定性试验；挑选出革兰氏染色阴性，能与FeCl3溶液形成红褐色沉淀者，将菌株进行平板划线纯分离，最后将纯分离菌株转接斜面固体培养基上，培养后放于4℃冰箱中保藏；

S6：筛选，将活化好的醋化醋杆菌菌株接种于基础液体培养基中，30℃静止培养48h制成醋化醋杆菌种子液，吸取2％醋化醋杆菌种子液至100mL液体发酵培养基中，30℃条件下静置培养，每隔24h测定一次产酸量，连续测定10天，每个菌株测三组平行，确定菌株的产酸能力，根据其试验结果绘制产酸量曲线，筛选出醋化醋杆菌株。

3.一种利用权利要求1所述的一种醋化醋杆菌制备复合冻干发酵剂的方法，其特征在于，所述制备步骤包括：

步骤一，菌株种子液的制备：从菌种保藏斜面上挑取少量醋化醋杆菌菌株接种于基础培养基中，30℃、静止培养48h制成醋化醋杆菌菌种子液；

步骤二，菌种复配，醋化醋杆菌接种量为1.0％，酿醋菌接种量为0.03％，接种于培养基中发酵9d得到复配菌种。

步骤三,菌体离心收集：在离心转速为5000r/min，离心时间为20min，离心温度为8℃条件收集菌泥；

步骤四，保护剂的制备：所述保护剂包括奶粉和糖醇，糖醇与脱脂奶粉比为1:1；所述糖醇包括甘露醇和乳糖，所述乳糖与甘露醇比为1:1；

步骤五，冻干：按照菌泥与保护剂比例1:3真空冻干得到复合冻干发酵剂。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤1中培养基包括液体培养基和固体培养基，分别为：

液体培养基：酵母浸膏1％，葡萄糖1％，无水乙醇4％；

固体培养基：酵母浸膏1％，葡萄糖1％，无水乙醇4％，琼脂2％，碳酸钙2％。

5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤三中的保护剂各成分及浓度为：奶粉浓度14.314％、甘露醇浓度2.831％，乳糖浓度9.347％。

6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤五冻干时菌悬液的最大厚度为0.75cm。

7.一种根据权利要求3所述的制备方法制备的一种醋化醋杆菌复合冻干发酵剂在制备云南老仓醋中的应用。

8.一种根据权利要求3所述的方法制备的一种醋化醋杆菌复合冻干发酵剂联合酵母菌复合冻干发酵剂在制备云南老仓醋中的应用。

9.根据权利要求8或者9所述的应用，其特征在于，所述醋化醋杆菌复合冻干发酵剂添加量为1％。

10.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，具体步骤包括：

1)酵母菌复合冻干发酵剂在马铃薯葡萄糖水中活化2代，调整菌浓度为3×10⁶CFU/mL备用；

2)云南老仓醋酒化阶段：10公斤茶、20公斤红糖，加入到200公斤水，煮开，过滤、冷却后放入有老发酵液的土坛中，将1)中菌液按照100：1接入糖茶水中进行酒化阶段发酵，密封发酵6d天；

3)云南老仓醋醋化阶段：步骤2)完成酒化阶段的发酵液中直接加入复合冻干发酵剂，按照酒液：复合冻干发酵剂为100:1的比例加入，发酵9天。