[发明专利]羰基还原酶突变体及其在环戊二酮类化合物还原中的应用

说明书

本发明提供了一种羰基还原酶突变体及其在环戊二酮化合物还原中的应用，具体地，本发明提供了一种羰基还原酶突变体，所述的突变蛋白为非天然蛋白，且所述突变蛋白具有催化环戊二酮化合物生成环戊酮醇的催化活性，并且所述突变蛋白在野生型的羰基还原酶的4个或4个以上的与酶催化活性相关的核心氨基酸发生突变。本发明的羰基还原酶突变体可以显著提高羰基还原酶的催化活性、提高环戊酮醇2R、3S手性产物的比例、提高环戊酮醇化合物的产率、时空产率、ee和de值。

本申请是申请日为2018年5月31日、申请号为201810555674.6、发明名称为“羰基还原酶突变体及其在环戊二酮类化合物还原中的应用”的发明专利申请的分案申请。

技术领域

本发明涉及酶及酶工程领域，具体地，本发明涉及羰基还原酶突变体及其在环戊二酮类化合物还原中的应用。

背景技术

对2,2-双取代的环戊二酮的羰基不对称还原是合成许多药物关键中间体的有效途径，例如在激素类药物中的左炔诺孕酮及其羟化物。左炔诺孕酮(式I)是目前我国市场上最为常见的紧急避孕药品为单方孕激素药品——左炔诺孕酮片的有效成分(每片0.75mg或每片1.5mg)，已纳入了我国的《国家非处方药药品目录》。

左炔诺孕酮的合成路线中涉及到了通过对双羰基中间体的不对称还原合成手性中间体，目前的生产路线是通过利用酿酒酵母转化制备手性中间体(路线1)。该路线的转化需要首先对酿酒酵母进行两天至三天的培养，随后加入底物乙基缩合物，而乙基缩合物的浓度为4g/L，转化时间最短的报道为3天。近几年的报道中仍然是野生菌对乙基缩合物的报道，如利用Pichia minuta CBS 1708实现乙基缩合物的转化，但是反应产物的ee值仅为90％，无法满足对立体选择性的要求。

利用野生菌进行转化不仅培养菌体时间长，而且由于野生菌中不会过量表达需要的羰基还原酶进行转化，因此催化效率低。

因此本领域迫切需要开发高效的羰基还原酶，从而实现环戊二酮类化合物，尤其是乙基缩合物的高立体选择性转化。

发明内容

本发明提供了一种高效的羰基还原酶，从而实现环戊酮醇的高立体选择性合成。

本发明第一方面提供了一种羰基还原酶突变蛋白，所述的突变蛋白为非天然蛋白，且所述突变蛋白具有催化环戊二酮类化合物生成环戊酮醇化合物的催化活性，并且所述突变蛋白在野生型的羰基还原酶的对应于SEQ ID NO.:1的选自下组的四个或四个以上与酶催化活性相关的核心氨基酸发生突变：

第91位异亮氨酸(I)；

第92位谷氨酸(E)；

第93位谷氨酰胺(Q)；

第142位亮氨酸(L)；

第144位亮氨酸(L)；

第147位组氨酸(H)；

第150位酪氨酸(Y)；

第187位异亮氨酸(I)；

第188位异亮氨酸(I)；

第191位谷氨酰胺(Q)；

第201位亮氨酸(L)；

第204位赖氨酸(K)；

第205位苯丙氨酸(F)；和

第246位亮氨酸(L)。

在另一优选例中，所述突变蛋白在野生型的羰基还原酶的对应于SEQ ID NO.:1的选自下组与酶催化活性相关的核心氨基酸发生突变：

第91位异亮氨酸(I)；