[发明专利]一种蓝藻水提物及其作为替代血清的应用

说明书

本发明涉及生物工程技术领域，尤其涉及一种蓝藻水提物及其作为替代血清的应用。所述水提物是蓝藻经过原料浸提、低温冷冻、室温解冻以及纳米级甲壳吸附柱纯化等过程获得，提取过程简单、安全性高，适合工业化放大生产。应用于肌肉细胞培养时，可直接溶于基础培养基，与培养基复配方式简单，对肌肉细胞生长无毒副作用，能完全替代血清用于肌肉细胞培养。本发明提到的蓝藻水提物应用到肌肉细胞培养过程替代血清，可满足细胞在培养瓶中实现长期连续传代培养的效果，可将其复配成培养液应用于生物反应器中扩大培养细胞肉。

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，尤其涉及一种蓝藻水提物及其作为替代血清的应用。

背景技术

在细胞体外培养过程中，血清是一种理想的细胞生长补充剂。血清含有血浆蛋白、多肽、脂肪、碳水化合物、生长因子、激素等成分，提供维持细胞生长的营养物质。虽然血清是细胞培养的理想补充剂，但其存在批次间质量差异大、易增加人畜共患病风险以及伦理道德问题等缺点，这些促使人们不断寻找血清的替代品。到目前为止，还未发现能较广泛替代血清并应用于所有细胞系的物质。

国内外学者研制了一系列用于骨髓瘤、CHO、BHK、Vero、淋巴细胞的血清替代物组合，比如各种重组蛋白、半乳糖、脂质、微量元素、维生素、氨基酸、激素等成分明确的组合替代血清维持细胞功能，但多种添加成分和基础培养基以不同比例复合，添加物冗杂，优化条件比较复杂。虽然上述技术公开了一些血清替代物，能满足一定的需要，但仍存在一些缺陷如成本高、食品安全性低、血清替代程度低等，会影响到血清替代物在细胞培养肉中的广泛应用。为进一步解决上述问题，减少动物源添加物的缺点，植物源血清替代物受到越来越多的关注。

蓝藻是自然界营养成分最丰富、最全面的生物，富含高质量的蛋白质，蛋白质含量高达60％-70％，而蛋白质又主要为水溶性蛋白，因此蓝藻水提物可能在细胞增殖和分化方面发挥积极作用，从而具有作为替代血清的潜力。现有技术仅有提及藻类多糖作为功能成分添加在无血清培养基中用于干细胞培养，但是并未指明是否可以作为血清替代物作用，也未提及藻类蛋白是否也能具有类似的替代作用，而且不同细胞增殖和分化所需要的培养条件各不相同，针对不同细胞类型开发的血清替代物不具有普适性。目前，现有技术应用于肌肉细胞培养的无血清培养基大多存在传代速率慢、细胞生长缓慢、传代次数有限、细胞扩增速度慢、难以实现扩大培养等问题，限制了无血清细胞培养肉的生产。

发明内容

为克服现有技术存在的上述问题，本发明提供了一种蓝藻水提物，作为血清替代物培养鱼肌肉细胞，可以实现全部替代血清和长期稳定扩大培养细胞的目标，可将其应用于细胞培养肉的规模化生产过程。

为达到上述目的，本发明具体通过以下技术方案实现，一种蓝藻水提物，其制备方法包括以下步骤：

(1)将蓝藻粉加水混合均匀，静置；

(2)冻融提取：取经过步骤(1)处理所获得藻液，冷冻-解冻处理后，离心取上清液；通过冻融方式破裂蓝藻细胞壁，提取水溶性活性物质。

(3)装柱：将纳米级虾蟹壳粉末装入层析柱，获得专用吸附层析柱装置；所述虾蟹壳来源于虾蟹等水产动物的甲壳，甲壳经超微粉碎获得纳米级甲壳粉。甲壳素是自然界中唯一的碱性多糖，甲壳素分子结构中存在氨基、羟基、乙酰氨基、糖苷键等多种活性基团，具有生物相容性好、天然无毒等多种独特的功能性质，同时，特殊的糖环结构赋予甲壳素分子独特的界面特性。因此，基于甲壳素的新材料具有独特的生物活性及功能特性。因为甲壳素特殊的纤维状结构，可以通过机械作用得到甲壳素纳米纤维。甲壳素纳米纤维可以吸附带负电的蛋白质、核酸等功能分子，从而有效富集功能因子(此处可否再进一步解释下，与普通柱子相比，甲壳素纳米纤维吸附得到的功能分子为何可以应用于细胞培养肉，如果不好补充，请忽略本条)。

(4)精制纯化：取经过步骤(2)处理所获得的上清液，流过步骤(3)所制备的吸附层析柱，收集流出液，流出液干燥即可。

进一步的，所述蓝藻为螺旋藻或聚球藻。