[发明专利]一种生物合成右旋-双环吉玛烯的重组大肠杆菌、构建方法及应用

权利要求书

1.一种生物合成右旋-双环吉玛烯的重组大肠杆菌，其特征在于，所述重组大肠杆菌以大肠杆菌K-12MG1655为母本菌株，包含以下(a)和(b)的功能强化：

(a)基因组中包含内源MEP途径关键酶编码基因的多克隆拷贝；

(b)含有双环吉玛烯合成模块相关基因表达质粒。

2.根据权利要求1所述的重组大肠杆菌，其特征在于：(a)中所述内源MEP途径关键酶编码基因是dxs、ispD、ispF和idi中的一个或多个；

所述多克隆拷贝是指在基因组中额外增加至少一个拷贝。

3.根据权利要求2所述的重组大肠杆菌，其特征在于：

所述编码基因dxs的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示；

所述编码基因ispD的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示；

所述编码基因ispF的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示；

所述编码基因idi的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示。

4.根据权利要求1所述的重组大肠杆菌，其特征在于：(b)中所述双环吉玛烯合成模块相关基因是Pets和fpps，其中：

所述基因Pets的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；

所述基因fpps的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。

5.如权利要求1所述的重组大肠杆菌的构建方法，其特征在于，(a)的功能强化包括如下步骤：

(1)构建含dxs、ispD、ispF、idi单个基因或多基因组合的操纵子片段，操纵子两翼分别携带与基因组被整合位点的同源序列；

(2)构建靶向大肠杆菌基因组不同整合位点的对应质粒pGRB-sgRNA，其包含不同整合位点对应的N20序列和trRNA编码区域；

(3)将步骤(1)、(2)所述各组操纵子片段、对应整合位点的各组质粒pGRB-sgRNA以及重组质粒pREDCas9共同转化入所述大肠杆菌母本菌株；

(4)筛选得到整合成功的大肠杆菌内源MEP途径组合强化菌株阳性克隆子；

所述编码基因dxs的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示；

所述编码基因ispD的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示；

所述编码基因ispF的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示；

所述编码基因idi的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示。

6.如权利要求1所述重组大肠杆菌的构建方法，其特征在于，(b)的功能强化包括如下方案：

(1)构建重组质粒pACYC-Pets，其包含双环吉玛烯合酶编码基因Pets；将重组质粒pACYC-Pets转化入经(a)功能强化的大肠杆菌内源MEP途径组合强化菌株中；或，

(2)构建重组质粒pACYC-Pets-fpps，其包含双环吉玛烯合酶编码基因Pets、法尼基焦磷酸合酶编码基因fpps；将重组质粒pACYC-Pets-fpps转化入经(a)功能强化的大肠杆菌内源MEP途径组合强化菌株中；

所述基因Pets的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；

所述基因fpps的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。

7.根据权利要求6所述的重组大肠杆菌的构建方法，其特征在于，所述重组质粒pACYC-Pets或pACYC-Pets-fpps均以质粒pACYCDuet-1为载体，其中T7启动子更换为Tac启动子。

8.如权利要求1所述重组大肠杆菌在生产右旋-双环吉玛烯中的应用。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：摇瓶发酵培养时，将权利要求1所述生物合成右旋-双环吉玛烯的重组大肠杆菌划线于添加氯霉素的固体LB培养基活化，挑取单菌落转接到添加氯霉素的试管LB培养基中，过夜培养后转接试管菌液进添加氯霉素的摇瓶培养基中；摇床培养至菌液OD₆₀₀达0.6-0.8，添加IPTG诱导表达，并加入正十二烷覆盖于发酵液表面收集产物，转移至摇床进行双相发酵。

10.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：发酵罐培养时，设置通气量为1vvm，发酵罐初始温度为37℃，按1％接种量将种子液转接进罐中发酵培养，当溶氧降至10％以下时提高搅拌转速，维持溶氧不低于10％；待罐中发酵液OD₆₀₀达到8以上时开始降温，并设置温度为23℃，待降温完成后添加IPTG进行诱导，发酵过程中设置自动流加碱液控制pH在6.8-7.2。