[发明专利]一种表达ASFV E183L基因的重组PRRSV的拯救方法和应用

说明书

本发明属于基因工程及疫苗制备技术领域，公开了一种表达ASFV E183L基因的重组PRRSV的拯救方法和应用。所述拯救方法包括以扩增的pBR322‑CMV‑linear作为载体，segment4A、P54、segment4B作为插入片段进行同源重组，得到pBR322‑CMV‑segment4‑P54质粒；以扩增的pBR322‑CMV‑linear作为载体，PRRSV JXA1R株基因组五个PCR扩增片段作为插入片段进行同源重组，得到pBR322‑CMV‑rJXA1R‑P54质粒，然后转染细胞表达，得到重组PRRSV。本发明方法病毒拯救成功率高，可用于开发非洲猪瘟及其它猪病疫苗。

技术领域

本发明属于基因工程及疫苗制备技术领域，具体涉及一种表达ASFV E183L基因的重组PRRSV的拯救方法和应用。

背景技术

非洲猪瘟(African swine fever,ASF)是由非洲猪瘟病毒(Africanswinefevervirus,ASFV)引起猪的一种急性、热性、致死性疾病,对养猪业的影响巨大。世界动物卫生组织(OIE)将其列为A类动物疫病，我国也将其列为动物疫病名录中的一类动物疫病。1921年，非洲猪瘟在非洲肯尼亚首次被发现，全世界至今没有研制出有效的疫苗。

ASFV为大型双链DNA虫媒病毒，具有囊膜，病毒粒子为二十面体结构，能够感染家猪、野猪，是非洲猪瘟病毒科的唯一成员，平均粒子直径在200nm左右，结构复杂，其基因组全长约179～193kb，含有150～167个开放阅读框(Open reading frames，ORFS)，编码超过200种蛋白质，同时ASFV基因组还编码DNA复制、基因转录和RNA修饰相关酶类，以及调节宿主细胞功能和参与病毒免疫逃逸的相关蛋白质。

p54蛋白是ASFV表达的Ⅰ型跨膜结构蛋白，位于病毒内层囊膜，由基因E183L基因编码，其大小约为19.9kD。该蛋白对病毒形态的形成至关重要，在病毒形成的早期阶段的内质网募集和病毒颗粒组装完成后的转运过程中具有重要作用。该蛋白涉及病毒侵入，具有良好的免疫原性，通过中和抗体实验，p54的抗体能够阻断病毒颗粒吸附到易感细胞上。另外，有研究表明p54具有免疫原性，能够刺激机体产生针对该蛋白的抗体，可能是理想的ASFV亚单位疫苗抗原。

猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)是猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratorysyndromevirus,PRRSV)引起的一种猪传染病，其特征是引起生长和育肥猪的呼吸系统疾病以及妊娠母猪的繁殖障碍，是目前对世界养猪业造成危害最大的重要传染病之一。PRRSV具有严格的宿主特异性及组织嗜性，主要感染猪的肺泡巨噬细胞和树突状细胞，引起急性或持续性感染。

PRRSV的遗传和抗原多样性，以及PRRSV感染的免疫抑制和持久性，对开发有效疫苗提出了巨大挑战。然而，反向遗传学的发展为体外拯救RNA病毒铺平了道路。这项技术使在分子水平上操纵病毒基因组成为可能。为开发PRRSV作为表达外源基因的病毒载体和构建转基因疫苗提供了有效途径。通过利用PRRSV复制过程中多个亚基因组RNA(sgRNA)的独特转录和翻译，构建表达多个外源基因的重组PRRSV病毒载体疫苗变的可行。

研究显示，当使用PRRSV感染性克隆作为表达载体时，已经报道了几个插入位点，包括Nsp2、ORF1b和ORF2a之间的区域，以及ORF7和3'-UTR之间的位点。其中，PRRSVORF1b和ORF2a之间的区域是外来序列的理想插入位点，因为该区域不与其他基因重叠，因此可以通过插入一个额外的独立转录单位来产生额外的亚基因组(sg)mRNA。有研究表明，在PRRSV的ORF1b和ORF2之间的插入GFP即使在连续传代37次后仍是稳定的，而在该位置插入PCV2衣壳蛋白的重组病毒接种动物之后可检测到针对插入基因的特异性抗体。这些结果表明，插入的外源基因被重组PRRSVs有效表达，并具有良好的免疫原性，可在宿主体内激发强烈的免疫反应。因此，这些重组病毒有可能被开发为针对猪病的多价多联疫苗。