[发明专利]一种检测蜜蜂梅氏热厉螨的引物探针组合物及其检测方法

说明书

本发明公开了一种检测蜜蜂梅氏热厉螨的引物探针组合物及其检测方法。具体地公开了用于检测蜜蜂梅氏热厉螨的引物对，所述引物对为特异性扩增COX1基因或含有所述COX1基因片段的一对引物，所述COX1基因的核苷酸序列为SEQ ID No.1。本发明利用从国内流行蜂群分离的多株梅氏热厉螨进行DNA扩增和序列分析比对，筛选核酸保守序列作为靶目标，开发了用于检测蜜蜂梅氏热厉螨的引物探针组合物及实时荧光PCR检测方法。本发明的引物探针组合物及其检测方法灵敏度高，最低检测限为2.0拷贝/μL，并且特异性好，与其他蜂螨均无交叉反应，可用于蜜蜂梅氏热厉螨的检测及其与其他蜂螨的鉴别，以及进出口蜜蜂及蜂产品的检疫。

技术领域

本发明涉及动物卫生技术领域，具体涉及一种检测蜜蜂梅氏热厉螨的引物探针组合物及其检测方法。

背景技术

梅氏热厉螨(Tropilaelaps mercedesae)是小蜂螨的一个种，属于节肢动物门，蛛形纲，蜱螨亚纲，寄螨总目，中气门目，皮刺螨总科，和柯氏热厉螨(Tropilaelapskoenigerum)、亮热厉螨(Tropilaelaps clareae)、泰氏热厉螨(Tropilaelaps thaii)同属于热厉螨属(Tropilaelaps spp.)，统称小蜂螨。梅氏热厉螨是西方蜜蜂的主要寄生螨，在其原分布区的西方蜜蜂中均能发现，寄生水平能达90％，分布范围比亮热厉螨广，危害性更大，已经发展成西方蜜蜂的一种长期的危害性寄生虫。

梅氏热厉螨以吸食蜜蜂封盖子的血淋巴为生，常导致大量封盖幼虫和蛹变形或死亡，勉强出房的工蜂也出现体型畸形及机体和生理上的缺陷，致使蜂群的生产力严重下降，直接影响蜂群的发生发展，如果对发病群不加控制，蜂群很快就会死亡。目前小蜂螨的危害性已引起各国养蜂业、研究人员、蜂农的广泛关注。目前对于梅氏热厉螨的检测主要采用形态学方法，结合临床症状，通过开盖检查和箱底检查。由于到目前为止欧洲地区还没有梅氏热厉螨危害的报道，小蜂螨仅对亚洲地区的蜜蜂群产生危害，因此早期没有引起西方国家的重视，国内外对该类螨研究较少，目前还没有对于蜂螨的各个级型(卵、幼虫、若虫和成虫)的形态描述和生活史的详细报道，缺乏该螨典型的形态学鉴别特征，而且蜂群中有100多种与蜜蜂有关的螨，他们形态相似，所以仅靠形态学检查无法准确鉴定，而且实际检测效果也要依靠检测人员的业务水平与经验，容易造成漏检和错检。目前，未见有梅氏热厉螨的实时荧光PCR检测方法的报道。

鉴于此，研究和开发检测蜜蜂梅氏热厉螨的引物探针组合物及其检测方法，用于蜜蜂梅氏热厉螨的检测及其与其他蜂螨的鉴别，以及进出口蜜蜂及蜂产品的检疫，对于保障我国养蜂业的发展、生物安全和维护自然生态平衡具有重要意义。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是如何简单、快速、灵敏和/或特异地检测蜜蜂梅氏热厉螨(Tropilaelaps mercedesae)。所要解决的技术问题不限于所描述的技术主题，本领域技术人员通过以下描述可以清楚地理解本文未提及的其它技术主题。

为解决上述技术问题，本发明首先提供了用于检测蜜蜂梅氏热厉螨的引物对，所述引物对可为特异性扩增蜜蜂梅氏热厉螨线粒体细胞色素C氧化酶亚基I(cytochrome coxidase subunit I,COX1)基因或含有所述COX1基因片段的一对引物，所述COX1基因的核苷酸序列可为SEQ ID No.1。

进一步地，所述引物对由引物TME-F和引物TME-R组成，所述引物TME-F可为SEQ IDNo.2所示的单链DNA分子；所述引物TME-R可为SEQ ID No.3所示的单链DNA分子。

所述引物TME-F为正向引物，所述引物TME-R为反向引物。

所述正向引物TME-F和反向引物TME-R为特异性扩增蜜蜂梅氏热厉螨(Tropilaelaps mercedesae)的COX1基因的引物对，即用于检测蜜蜂梅氏热厉螨的特异引物对。