[发明专利]具有犬自然杀伤细胞体外激活功能的组合物及体外培养的方法

说明书

本发明涉及细胞体外培养领域，公开了一种具有犬自然杀伤细胞体外激活功能的组合物及体外培养的方法。该组合物含有糖皮质激素、人白介素2、人白介素15、CD335单克隆抗体和CD16单克隆抗体，避免了使用饲养层细胞共培养激活和扩增犬自然杀伤细胞带来的临床风险，降低了犬自然杀伤的制备成本和技术要求。通过该组合物培养得到的犬自然杀伤细胞能够高效扩增，而且得到的自然杀伤细胞纯度高，避免其他非自然杀伤细胞的存在引起的细胞毒性和细胞因子风暴等副作用，降低临床应用风险。

技术领域

本发明涉及细胞体外培养领域，具体涉及一种具有犬自然杀伤细胞体外激活功能的组合物及体外培养的方法。

背景技术

自然杀伤细胞(natural killer cell，NK)是机体重要的免疫细胞。NK细胞可以选择性杀伤肿瘤细胞，病毒感染细胞，衰老细胞等靶细胞，在肿瘤免疫治疗，病毒疾病免疫治疗，抗衰老治疗中发挥重要作用。在临床应用中，NK细胞主要是通过培养外周血单个核细胞(Peripheral blood mononuclear cell，PBMC)获得，体外培养可以扩增并纯化NK细胞，使其达到临床应用的数量和纯度要求。

目前，NK细胞的体外培养方法主要有饲养层细胞共培养法和单纯细胞因子刺激法。但是，在宠物犬上，高效的临床级的NK细胞体外培养方法未见有报道。

饲养层细胞共培养法是指将一些特定的细胞经有丝分裂阻断剂或者辐照处理所得的细胞，这些细胞保持代谢活性但不增殖，可以提供一些细胞生长所必需的细胞因子。比如经100/125-Gy-辐照后的K562细胞系(一种人源的慢性髓系白血病肿瘤细胞系)、EL08-1D2(小鼠胚胎干细胞源饲养细胞系)或者人类Epstein-Barr病毒转化的淋巴母细胞系，上述细胞经过基因改造后均可作为饲养层用于NK细胞的体外共培养，目前常用的是K562细胞。但是，饲养层细胞共培养法存在两个缺陷。第一，制备基因改造的饲养层细胞技术要求高，成本高。第二，饲养层细胞比如K562细胞本身为癌细胞，如果用此类细胞作为饲养层，不可避免的带来了临床应用的风险。

单纯细胞因子刺激法是指在不使用饲养层细胞共培养的情况下，加入相应细胞因子，使PBMC中的NK细胞激活并增殖。目前有多种细胞因子可用于体外激活并扩增NK细胞。但是各个物种NK细胞扩增培养所需的细胞因子可能存在不同。目前较为清楚的是人类和小鼠的NK细胞需要的细胞因子。但在宠物犬中，NK细胞增殖所需要的细胞因子及其用量尚不清楚，直接套用人类和小鼠的细胞因子配方，犬NK细胞增殖能力欠佳，扩增后的NK细胞纯度较低，不能满足临床需要。

发明内容

本发明的目的是为了克服现有技术存在的饲养层细胞共培养技术的技术要求高，成本高，并存在风险和单纯细胞因子刺激法使犬NK细胞增殖能力低，扩增后的NK细胞纯度低不能满足临床需要的问题，提供了一种高效的具有犬自然杀伤细胞体外激活功能的组合物及其体外培养的方法，该组合物及其体外培养的方法，可以避免使用饲养层细胞对的宠物犬NK细胞进行体外培养，成本和技术要求低，可以提高NK细胞的增值能力，并确保扩增后的NK的纯度，使NK细胞用于宠物犬临床治疗和保健。

为了实现上述目的，本发明第一方面提供一种具有犬自然杀伤细胞体外激活功能的组合物，该组合物含有糖皮质激素类、人白介素2、人白介素15、CD335单克隆抗体和CD16单克隆抗体。

本发明第二方面提供一种犬自然杀伤细胞的体外培养方法，该方法包括：将犬外周血单个核细胞与上述的组合物混合进行激活培养。

通过上述技术方案，本发明在体外扩增犬NK细胞时，不使用饲养层细胞，避免了使用肿瘤细胞饲养带来的临床应用风险，使后续细胞回输治疗更为安全，本发明能够高效的在体外从犬PBMC中扩增培养犬的NK细胞，使其细胞数量在载体外扩增20倍以上。仅需静脉采血减小了对宠物机体的伤害。使用本发明的激活组合物还可以获得高纯度的NK细胞，避免其他非NK细胞的存在引起的副作用，产生细胞毒性和细胞因子风暴等，降低风险，提高临床使用的安全性。

附图说明