[发明专利]检测猕猴桃褪绿环斑病毒的引物对、引物组、试剂盒及方法

说明书

本发明属于病毒检测技术领域，具体涉及检测猕猴桃褪绿环斑病毒的引物对、引物组、试剂盒及方法。本发明提供的引物对RPA‑AcCRaV‑F/RPA‑AcCRaV‑R，能够扩增猕猴桃褪绿环斑病毒的基因组RNA，特异性好，实现猕猴桃褪绿环斑病毒的检测。将所述引物对与探针结合使用，得到检测猕猴桃褪绿环斑病毒的引物组，能直接对猕猴桃褪绿环斑病毒进行RT‑RPA‑LFD检测，检测时间短，结果可用肉眼判读，更加方便，实现了对待检样品的快速检测，并且灵敏度高，特异性好，最低检测限为10supgt;‑8/supgt;ng/μL。

技术领域

本发明属于病毒检测技术领域，具体涉及检测猕猴桃褪绿环斑病毒的引物对、引物组、试剂盒及方法。

背景技术

猕猴桃是全球重要的园艺产品之一，因其果肉含有丰富的维生素C、矿物质及膳食纤维，深受大众的青睐。病害的侵染会影响猕猴桃的产量和质量，甚至影响猕猴桃产业的健康发展。猕猴桃褪绿环斑病毒(Actinidia chlorotic ringspot-associated virus，AcCRaV)是一种特异性侵染猕猴桃的病毒，该病毒在猕猴桃产区普遍发生，且通常和其它病毒复合侵染。猕猴桃在感染AcCRaV时，常表现出叶片褪绿、斑驳和环斑等症状，严重影响猕猴桃的产量和品质。

果树病毒的检测是病毒病害预测、预报及防治的关键环节。目前报道的AcCRaV检测方法主要是逆转录PCR(Reverse transcription-PCR，RT-PCR)，该检测方法需要经过样品采集，研磨，RNA提取，反转录，PCR，电泳等过程，且需配置PCR仪，电泳仪，凝胶成像仪等专业设备，过程相对繁琐且费钱费时费工；此外，由于RT-PCR的灵敏度有限，在检测病毒含量较低的材料时容易出现假阴性的结果。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种检测猕猴桃褪绿环斑病毒的引物对、引物组、试剂盒及方法，提高猕猴桃褪绿环斑病毒检测的灵敏性、特异性和检测速度。

为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

本发明提供了一种利用RPA检测猕猴桃褪绿环斑病毒的引物对，包括序列为SEQID NO.1所示的上游引物RPA-AcCRaV-F和序列为SEQ ID NO.2所示的下游引物RPA-AcCRaV-R。

本发明还提供了一种利用RPA-LFD检测猕猴桃褪绿环斑病毒的引物组，包括序列为SEQ ID NO.1所示的上游引物RPA-AcCRaV-F、序列为SEQ ID NO.2所示的下游引物RPA-AcCRaV-R和序列为SEQ ID NO.3所示的探针AcCRaV-nfo-probe。

优选的，所述探针AcCRaV-nfo-probe中的Y被[THF]替换，所述探针AcCRaV-nfo-probe的5’端添加FITC标记，3’端添加聚合酶扩增阻断基团。

本发明还提供了一种利用RPA-LFD检测猕猴桃褪绿环斑病毒的检测试剂盒，包括上述技术方案所述的引物组、反应缓冲液和阳性对照。

优选的，还包括逆转录试剂、核酸提取试剂和RNase抑制剂。

本发明还提供了一种基于RT-RPA-LFD检测猕猴桃褪绿环斑病毒的方法，包括如下步骤：

提取含有猕猴桃褪绿环斑病毒的待测样品的总RNA；

利用上述技术方案所述引物组对总RNA进行RT-RPA反应，得RPA产物；

利用测流层析试纸条对所述RPA产物进行检测，判断猕猴桃待检测样品是否含有猕猴桃褪绿环斑病毒。