[发明专利]一种高产溶菌酶的毕赤酵母菌株及其应用

说明书

本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种高产溶菌酶的毕赤酵母菌株及其应用。本发明首先将溶菌酶基因在毕赤酵母（Pichia pastoris）宿主中进行过表达，构建得到重组菌株；然后通过紫外诱变的方法获得溶菌酶产量显著提高的突变菌，命名为毕赤酵母RONG1‑14（Pichia pastoris RONG1‑14），已于2022年6月27日保藏于中国武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 2022977。

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种高产溶菌酶的毕赤酵母菌株及其应用。

背景技术

溶菌酶（lysozyme）又称胞壁质酶（muramidase）或N-乙酰胞壁质聚糖水解酶（N-acetylmuramide glycanohydrlase），是一种能水解细菌中黏多糖的碱性蛋白质。溶菌酶广泛分布于动物、植物和微生物中，在哺乳动物的血浆、气管、肠道、胃、肾和肝等组织细胞中均有所表达。其作用机理主要是通过破坏细胞壁中的N-乙酰胞壁酸和N-乙酰氨基葡萄糖之间的β-1,4糖苷键，使细胞壁不溶性黏多糖分解成可溶性糖肽，导致细胞壁破裂内容物溢出而使细菌溶解。

抗生素的大量滥用以及药物残留、农药污染等一系列问题令人寝食难安。抗生素的使用长久以来以改善动物的营养状况和抗菌促生长为目的，从而对能有效抗菌，促生长、可应用、无残留、无污染的饲用抗生素替代物的研究备受关注。溶菌酶作为动物自身的一种非特异性免疫因子，以其广谱高效的杀菌、无残留、无污染、对人体安全、无毒、无害的特性吸引众多研究者的视线。研究发现，溶菌酶可作为潜在的抗生素替代品运用于畜禽饲料、食品、生物工程、医疗和水产等领域。

溶菌酶本身是一种天然蛋白质，由于其安全、无残留、对致病菌的杀菌效果，是一种安全性高的饲料添加剂，在饲料应用中有广阔的应用前景。（1）溶菌酶在仔猪饲料中使用，可以提供日增重和采食量，降低料肉比和腹泻率，改善仔猪健康水平。（2）溶菌酶在家禽饲料中使用，可以改善禽类生长性能，降低发病率，提高成活率，同时还能提高血清中的溶菌酶含量和免疫功能，对家禽抵御疾病有着积极的作用效果。（3）溶菌酶在反刍动物饲料中使用，可以有效改善其奶质水平，减少药物使用量，降低奶中的药物残留，减少耐药性的形成，同时溶菌酶还作为一种药治疗奶牛的隐性乳房炎和子宫内膜炎，效果显著。同时，溶菌酶可应用于水产动物的病害防治，减少或替代水产养殖中使用化学药物。因此，溶菌酶作为一种安全高效的绿色添加剂，在目前食品安全越来越重视的背景下，将在畜牧生产中发挥越来越重要的作用。

随着产品市场竞争的日趋激烈，发展绿色、安全、优质、高效的畜产品将是畜牧业发展的必然趋势，绿色的畜产品的生产备受社会的关注和人们的青睐。鉴于饲用抗生素对人类健康与环境造成的危害，许多的国家特别是经济发达的国家已经或准备禁止饲用抗生素的使用。抗生素的替代问题已迫在眉睫，溶菌酶无疑是个不错的选择。很多的研究与应用证明，饲用溶菌酶可以有效提高动物的生长性能，满足人们对畜产品的要求，提高畜牧业的经济效益，降低对环境以及人类健康带来的危害。但目前市场上的溶菌酶产品存在酶活低、产量低、性质不稳定等问题，导致其难以满足饲料工业发展的需求。

发明内容

本发明为解决现有技术问题，提供了一种高产溶菌酶的毕赤酵母菌株及其应用。申请人首先将溶菌酶基因在毕赤酵母（Pichia pastoris）宿主中进行过表达，构建得到重组菌株；然后通过紫外诱变的方法获得溶菌酶产量得到显著提高的突变菌，从而大幅度降低溶菌酶的生产成本，促进该酶的广泛应用。

本发明一方面涉及一种毕赤酵母工程菌，其携带有表达溶菌酶基因的重组质粒。

所述溶菌酶基因的核苷酸序列为SEQ ID NO：1，编码的氨基酸序列为SEQ ID NO：2。

本发明另一方面涉及一种毕赤酵母突变菌株，是以上述毕赤酵母工程菌为出发菌，通过紫外诱变的方法获得的。