[发明专利]一种改造的D-阿洛酮糖3-差向异构酶及其应用

说明书

本发明公开了一种改造的D‑阿洛酮糖3‑差向异构酶及其应用，涉及蛋白质工程技术领域，该改造DTEase酶由DTEase序列和C端融合的多聚精氨酸标签构成，命名为DTEase‑5R。通过对解纤维素梭菌DTEase蛋白序列的C端添加RRRRR标签，使其产量比之前提高了5.5倍，Tm值增加了7℃，本发明提供的DTEase在工业生产D‑阿洛酮糖的应用中具有更好的应用场景。

技术领域

本发明涉及蛋白质工程技术领域，具体涉及一种改造的D-阿洛酮糖3-差向异构酶及其应用。

背景技术

D-阿洛酮糖，属于D-果糖的碳-3同分异构体，是一种稀有糖。与常规的单糖相比，它是一种能量很低的单糖，因此在食品工业中通常用作可口的甜味剂或膳食补充剂。D-阿洛酮糖还具有抗氧化、降血糖、降血脂等活性，在工业领域具有广阔的应用前景。目前采用化学合成法生产D-阿洛酮糖难度较大。因为D-阿洛酮糖只存在于自然界中的少数水果中，因此很难提取，常用的生产方式是通过生物转化工艺法生产D-阿洛酮糖，利用一种D-阿洛酮糖3-差向异构酶(D-tagatose3-epimerase，DTEase)催化D-果糖的转化成D-阿洛酮糖[1.Hossain,Akram et al.“Rare sugar D-allulose:Potential role and therapeuticmonitoring in maintaining obesity and type 2diabetes mellitus.”Pharmacologytherapeutics vol.155(2015):49-59.]。然而，由于一些D-阿洛酮糖3-差向异构酶稳定性相对有限，其中大多数不适合工业应用，因此寻找热稳定好的DTEase对于D-阿洛酮糖的工业生产非常重要。

来源于解纤维素梭菌的DTEase酶是在2011年发现的一种新的DTEase，该酶同样具有将D-果糖的转化成D-阿洛酮糖的功能，且与之前物种来源的DTEase相比，具有更好的热稳定性，可以在55℃的情况下，发挥活性且半衰期长，因此在D-阿洛酮糖的工业生产上具有广阔的应用前景[2.Chan,Hsiu-Chien et al.“Crystal structures of D-psicose3-epimerase from Clostridium cellulolyticum H10 and its complex with ketohexosesugars.”Proteincell vol.3,2(2012):123-31.]。

发明内容

本发明的目的在于提供了一种改造的D-阿洛酮糖3-差向异构酶及其应用，该改造的D-阿洛酮糖3-差向异构酶相比较野生型的DTEase酶具有更高热稳定性和纯化产量。

本发明通过以下技术方案来实现上述目的：

本发明提供了一种改造的D-阿洛酮糖3-差向异构酶，该改造的D-阿洛酮糖3-差向异构酶由DTEase序列和C端融合的多聚精氨酸标签构成。

进一步改进在于，所述多聚精氨酸标签的多肽序列为RRRRR，改造的DTEase酶命名为DTEase-5R。

进一步改进在于，所述改造的D-阿洛酮糖3-差向异构酶的氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示。

本发明还提供了一种多核苷酸，所述多核苷酸编码上述改造的D-阿洛酮糖3-差向异构酶。

进一步改进在于，所述多核苷酸的序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明还提供了一种重组质粒，所述重组质粒为含有上述多核苷酸且能够翻译表达出上述改造的D-阿洛酮糖3-差向异构酶的表达载体。

进一步改进在于，所述表达载体为pET-28a载体。

本发明还提供了一种重组工程菌，所述重组工程菌包含上述重组质粒。

进一步改进在于，所述工程菌为大肠杆菌BL21(DE3)。