[发明专利]PD-1蛋白表达载体及其应用

说明书

本发明公开了一种PD‑1蛋白表达载体及其应用，其中，PD‑1蛋白表达载体包括AAV载体，AAV载体的多克隆位点的酶切位点间插入有PD‑1基因片段。本发明的PD‑1蛋白表达载体，能够在人体内长期表达PD‑1蛋白，PD‑1蛋白和肿瘤细胞的PD‑L1特异性结合，从而降低肿瘤细胞对T细胞的负调节作用，提高T淋巴细胞对肿瘤细胞生长的抑制作用。

技术领域

本发明涉及分子生物技术领域，具体而言，涉及一种PD-1蛋白表达载体及其应用。

背景技术

程序性细胞死亡蛋白(PD-1)是一种具有268个氨基酸的I型膜蛋白，属于CD28家族成员，其基因位于2号染色体上，主要在T细胞和pro-B细胞上表达。

PD-1的结构主要包括胞外免疫球蛋白可变区(IgV)结构、疏水的跨膜区以及胞内区，胞内区尾部有2个独立的酪氨酸残基，氮端的酪氨酸残基参与构成一个免疫受体酪氨酸抑制基序(immunoreceptor tyrosine based inhibitory motif，ITIM)，碳端酪氨酸残基则参与构成一个免疫受体酪氨酸转换基序(immunoreceptor tyrosine based switchmotif，ITSM)。

PD-L1和PD-L2是PD-1的两个糖蛋白配体，其中，PD-L1是肿瘤细胞产生的配体蛋白，能够和T淋巴细胞的PD-1相结合。肿瘤细胞的PD-L1与T细胞上的PD-1结合后，促使PD-1的ITSM结构域中的酪氨酸发生磷酸化，进而引起下游蛋白激酶Syk和PI3K的去磷酸化，抑制下游AKT、ERK等通路的活化，最终抑制T细胞活化所需基因及细胞因子的转录和翻译，发挥负向调控T细胞活性的作用。

目前常见抗肿瘤药物的研究聚焦于靶向PD-1单克隆抗体，但是单抗药物具有免疫原性，个体差异性以及适应症有限等局限性。

此外，蛋白类药物在体内存在半衰期，因而在治疗期间，需要多次给药，这也会降低患者依从性，影响治疗效果。

因此，如何提高药物的治疗效果，扩大药物的适应症范围是开发肿瘤药物的难点。

发明内容

为了解决上述问题，本发明的第一目的在于提供一种PD-1蛋白表达载体，包括AAV载体，AAV载体的多克隆位点的酶切位点间插入有PD-1基因片段，以实现通过表达载体在人体内长期表达PD-1蛋白，PD-1蛋白和肿瘤细胞的PD-L1特异性结合，从而降低肿瘤细胞对T细胞的负调节作用，提高T淋巴细胞对肿瘤细胞生长的抑制作用。

本发明的一种实现方式中，PD-1基因片段的序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明的一种实现方式中，多克隆位点的酶切位点为限制性内切酶Not I和EcoRI的酶切位点。

本发明的第二目的在于提供一种包含上述PD-1蛋白表达载体的转化体。

本发明的一种实现方式中，转化体包括宿主细胞以及转化到宿主细胞的表达载体。

本发明的一种实现方式中，宿主细胞为大肠埃希氏杆菌细胞、HEK293细胞、Hela细胞或Vero细胞。

本发明的第三目的在于提供一种药物组合物，药物组合物包括：

上述PD-1蛋白表达载体，以及药学上或生理学上可接受的药物载体。

本发明的一种实现方式中，药物载体包括填充剂、稀释剂和赋形剂中的至少一种。

本发明的第四目的在于提供上述PD-1蛋白表达载体、上述转化体或上述药物组合物在制备癌症治疗药物中的应用。

本发明的一种实现方式中，癌症为非小细胞肺癌。