[发明专利]一种冬凌草实时荧光定量PCR内参基因的筛选方法及其应用

说明书

本发明涉及冬凌草实时荧光定量PCR内参基因的筛选方法及其应用，可有效解决内参基因的筛选和验证的问题，其解决的技术方案是，所述的冬凌草实时荧光定量PCR内参基因中，GADPH、18S和eIF是最为稳定的3个内参基因；在不同胁迫处理下，UBQ、HIS和PP2A是盐胁迫和脱水胁迫下最为稳定的3个内参基因；UBQ、eIF和PP2A是水杨酸、茉莉酸甲酯和脱落酸处理下最为稳定的3个内参基因，本发明通过对盆栽的冬凌草进行了不同组织以及不同胁迫处理，筛选出了扩增效率高、稳定性好的冬凌草内参基因，是冬凌草实时荧光定量PCR内参基因的筛选及其应用上的创新。

技术领域

本发明涉及植物基因工程技术，特别是一种冬凌草实时荧光定量PCR内参基因的筛选方法及其应用。

背景技术

冬凌草为唇形科香茶菜属植物碎米桠(Isodon rubescens(Hemsl.)Hara)的干燥地上部分，主产于我国河南济源太行山一带，为河南济源地区道地药材。1977年，冬凌草被收入《中华人民共和国药典》，并编入《全国中草药汇编》，其味苦、甘，微寒；具有清热解毒、活血止痛等多种功效，用于咽喉肿痛，癥瘕痞块，蛇虫咬伤。

冬凌草含有萜类、黄酮类、生物碱等多种活性成分，其中主要活性成分为冬凌草甲素(Oridonin)和冬凌草乙素(Ponicidin)等。现代药理学实验研究表明冬凌草甲素对乳腺癌、食管癌、喉癌、结肠癌等多种癌症有显著疗效，可作为抗肿瘤药。因此，冬凌草作为一种药理活性良好、肝肾毒性较低的抗肿瘤植物，已成为研究其药理功效的重要对象。随着分子生药学的发展和进步，冬凌草主要活性成分的生物合成和基因调控的功能研究越来越受到人们的重视。

实时荧光定量PCR(RT-qPCR)是基因功能验证的重要方法，而RT-qPCR技术需要有内参基因为参考，因此，其最重要的一个环节是内参基因的筛选和验证。然而，现有技术中还没有冬凌草内参引物的相关研究公开，这成为对冬凌草基因的功能验证和分子生物学研究的主要障碍。因此，筛选冬凌草不同条件下稳定表达的内参基因，是冬凌草基因功能研究的前提；有利于对冬凌草相关基因表达水平的研究结果可靠性提供技术支持。

发明内容

针对上述情况，为解决现有技术之缺陷，本发明之目的就是提供一种冬凌草实时荧光定量PCR内参基因的筛选方法及其应用，可有效解决内参基因的筛选和验证的问题。

本发明解决的技术方案是，所述的冬凌草实时荧光定量PCR内参基因中，GADPH、18S和eIF是最为稳定的3个内参基因；在不同胁迫处理下，UBQ、HIS和PP2A是盐胁迫和脱水胁迫下最为稳定的3个内参基因；UBQ、eIF和PP2A是水杨酸、茉莉酸甲酯和脱落酸处理下最为稳定的3个内参基因，所述的GADPH的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；所述的18S的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示，所述的eIF的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示，所述的UBQ的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示，所述的HIS的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示，所述的PP2A的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示。

所述的内参基因GADPH扩增引物序列为：

F：5’-GGCAAAGTTCTCCCTGCTCT-3’；

R：5’-CCCCTCAGACTCCTCCTTGA-3’；

所述的内参基因18S的引物序列是：

F：5’-ACCACATCCAAGGAAGGCAG-3’；

R：5’-TCTTCATCGATGCGAGAGCC-3’；