[发明专利]一种体外分离培养循环肿瘤细胞的方法

权利要求书

1.一种体外分离培养循环肿瘤细胞的方法，其特征在于，包括：

（1）分离：将癌症患者的外周血或胸水样本用无菌生理盐水稀释，直接采用高密度微孔阵列膜过滤，所述高密度微孔阵列膜上每平方厘米的孔数为92-98万个孔/ cm²，孔径为6-8μm；然后用无菌生理盐水或磷酸缓冲液PBS清洗高密度微孔阵列膜，进行CTC镜检及成活细胞检测；

（2）培养：在无菌操作条件下，将高密度微孔阵列膜转移至培养皿，加入培养液，进行培养，建立循环肿瘤细胞体外培养的方法；

步骤（2）中，培养液包括基本培养基和添加物，

所述基本培养基包括体积比为1:1的RPMI 1640和DMEM/F12；

所述添加物的组成及含量包括：体积百分比为2%的胎牛血清FBS；质量百分比为0.05%的牛血清白蛋白BSA；非必需氨基酸NAAS，1X使用浓度，从100X NAAS母液配制；抗生素，1X使用浓度，从1000X三类混合抗生素母液配制，所述三类混合抗生素为青霉素，链霉素及抗支原体抗生素；1-2 μg/mL转铁蛋白；25-50 μg/mL人胰岛素；300-500 ng/L hEGF以及5-10ng/L hFGF；

所述癌症患者所患的癌症为肝癌、胃癌、结直肠癌、宫颈癌、肺癌、淋巴癌或乳腺癌。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（1）中，采用高密度微孔阵列膜过滤包括一级过滤或多级过滤；多级过滤时，高密度微孔阵列膜的孔径逐级减小。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（1）中，将癌症患者的外周血样本采用无菌生理盐水稀释2-5倍，轻轻充分混匀，放置于室温3~5分钟，然后进行过滤。

4.根据权利要求1-3任意一项所述的方法，其特征在于，步骤（2）中，在37℃细胞培养箱中培养，5％CO₂饱和度，每隔3~4天更换培养液；单个CTC经3~5天，长成小细胞团CTM，1~2周长成更大的细胞团，有的CTC细胞团会脱落或分散开来形成单个悬浮细胞或附着分化细胞。

5.根据权利要求1-3任意一项所述的方法，其特征在于，采集癌症患者的外周血后，加入CPDA-1抗凝剂，混匀，可在4℃下保存3~5周，备用；外周血与CPDA-1抗凝剂的体积比为1：0.15。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，外周血与CPDA-1抗凝剂混合后，还加入抗生素和/或血小板抑制剂盐酸替罗非班；混合液中，抗生素为1X；血小板抑制剂盐酸替罗非班在混合液中的质量浓度为2-10 μg/mL。

7.根据权利要求1-3任意一项所述的方法，其特征在于，步骤（1）中，采用无菌生理盐水或PBS缓冲液清洗高密度微孔阵列膜3~4次，加入PBS缓冲液，进行CTC镜检及成活细胞检测。