[发明专利]一种双特异性探针捕获磁珠及其制备方法和应用

说明书

本发明属于生物检测领域，具体地，涉及一种捕获磁珠的制备方法。更具体地，涉及一种双特异性探针捕获磁珠制备方法。本发明提供了一种双特异探针捕获磁珠的制备方法，所述方法包括：将捕获磁珠与双特异性探针进行耦合，其中，所述双特异性探针5’端15bp～25bp区域位置引入次黄嘌呤；其中，所述双特异性探针的长度为20～70bp。使用本发明的磁珠能够更好的捕获靶标片段，保证捕获的稳定性，灵敏度更高。对于复杂样本类型中低浓度核酸可显著提高检出率，同时，可以有效降低错配带来的错误捕获。

技术领域

本发明属于生物检测领域，具体地，涉及一种捕获磁珠的制备方法。更具体地，涉及一种双特异性探针捕获磁珠制备方法。

背景技术

目前，基于复杂样本(如粪便样本)DNA的筛查技术，由于其同时具备非侵入性和高敏感性的优点，因此，被用来当做肠道微生物或癌症筛查的手段，多款基于DNA的肠癌筛查产品已获得国家药监局的批准，其检测靶标主要包括：Septin9、SDC2、BMP3、NDRG4、miRNA等。

与检测患者血浆、尿液或胸腹水中游离DNA的癌症早期筛查方法相比，检测患者的粪便样本具有更高的敏感度和准确性。然而，对于粪便样本而言，其样本中所含成分复杂，大多为各种类型的细菌和食物残渣，对靶标检测造成较大的背景干扰和抑制，并且癌细胞的含量较低，使靶标的检出率低且不稳定。目前，市面上的普通磁珠法提取试剂盒对于血浆、尿液或胸腹水这类样本的提取和纯化可以满足其后续检测需求，但对于粪便样本等复杂类样本，将对应的目的片段富集提取和纯化存在一定难度。

基于此，有研究将DNA/RNA捕获探针与羧基磁珠的羧基基团结合形成捕获磁珠，在复杂类型的样本中对特定序列进行抓取。然而，目前使用的常规磁珠捕获探针为一段特定的核苷酸序列，长度30-50bp左右，长度越长其捕获特异性越高，但过长的序列会导致其自身形成折叠二聚体或发夹结构，影响后续磁珠捕获效率。尤其在检测类似于肠癌甲基化与非甲基化的靶标时，其特异性检测位点主要是CpG位点的差异，由于该位点的特殊性，在检测过程中有可能出现甲基化与非甲基化靶标仅存在1-3个碱基的差异，普通捕获探针在单个甚至3个的碱基发生错配时仍然能正常结合捕获，这种非特异性的捕获会导致后续捕获核酸量不足或目的片段检测不准确。

因此，本领域需要一种用于从复杂样本中特异提取靶标核酸的方法，其准确性高，灵敏度好。

发明内容

有鉴于此，第一方面，本发明提供一种双特异探针捕获磁珠的制备方法，其特征在于，所述方法包括：

将捕获磁珠与双特异性探针进行耦合，

其中，所述双特异性探针5’端采用伯氨基修饰，且所述探针5’端15～25bp区域位置引入次黄嘌呤；

其中，所述双特异性探针的长度为20～70bp。

在一些具体的实施方案中，所述次黄嘌呤的数量为1～8。

在一些具体的实施方案中，所述次黄嘌呤的数量为3～6。

在一些具体的实施方案中，所述次黄嘌呤的数量可以为1、2、3、4、5、6、7，或8。

在一些具体的实施方案中，所述捕获磁珠为羧基磁珠，所述双特异性探针5’端采用伯氨基修饰。

在一些具体的实施方案中，对羧基磁珠的羧基基团进行活化，包括：

S1、将磁珠置于磁力架上吸附；

S2、加入2-吗啉乙磺酸后振荡混匀，置于磁力架吸附。

更优选地，所述活化磁珠的羧基基团包括：重复S2步骤。

在一些具体的实施方案中，所述将羧基磁珠与双特异性探针进行耦合包括：