[发明专利]质谱定量检测多肽产品中酪蛋白糖巨肽的标准特征多肽序列

说明书

本发明公开了质谱定量检测多肽产品中酪蛋白糖巨肽的标准特征多肽序列，属于检验检测技术领域。由于酪蛋白糖巨肽具有多种可能的糖基化修饰，故对其质谱定量难度较大。本发明对样品脱脂、沉淀蛋白后，通过酶切酪蛋白糖巨肽得到不含糖基化修饰位点的标准特征多肽序列，以精准的质量数避免了糖基化对于酪蛋白糖巨肽定量的影响。本发明筛选得到三条用于定量检测酪蛋白糖巨肽的多肽，氨基酸序列分别如SEQIDNo.1、SEQIDNo.2、SEQIDNo.3所示，其中，目标肽段3表现出更高的特异性，更适合用于定量分析待测样本中酪蛋白糖巨肽的含量。本发明实现了酪蛋白糖巨肽的精准定量分析，可用于确定产品中酪蛋白糖巨肽的含量是否达标。

技术领域

本发明涉及质谱定量检测多肽产品中酪蛋白糖巨肽的标准特征多肽序列，具体涉及酪蛋白糖巨肽的标准特征多肽序列，利用此多肽序列结合质谱可定量检测样品中的酪蛋白糖巨肽，属于检验检测技术领域。

背景技术

酪蛋白糖巨肽是由κ-酪蛋白酶解得到的一种糖基化多肽，不含苯丙氨酸，其糖基含有丰富的唾液酸，具有抗菌消炎、抑菌解毒、促进婴幼儿大脑发育的功效，因此是一种理想的苯丙酮尿症人群的特殊医学用途配方食品和婴幼儿配方奶粉的食品成分。对该类产品中酪蛋白糖巨肽的定性鉴定和定量分析可以确定商家是否存在以次充好的行为及酪蛋白糖巨肽食品质量是否达标。

酪蛋白糖巨肽的氨基酸序列是从κ-酪蛋白106位的甲硫氨酸到169位的缬氨酸组成的64个氨基酸，氨基酸序列有11种变异型。自然界中A型酪蛋白糖巨肽占据主导地位，其中121、131、133、136、142位的Thr是可能的糖基化位点，均为乙酰氨基半乳糖类氧糖苷键，糖基后端主要有半乳糖、唾液酸两种糖类，一个糖基有单糖到四糖不同的组成方式。酪蛋白糖巨肽的理论分子量在7-11kDa之间，但是在特定的pH下可以形成多聚体，具有不同的表观分子量。由此可见，酪蛋白糖巨肽分子量大，且糖基化程度复杂，分子形式多样，因此目前还没有非常成熟的方法可以对其进行准确地定量。

目前酪蛋白糖巨肽的检测方法主要是间接检测方法，如间苯二酚盐酸法检测唾液酸含量从而间接反映酪蛋白糖巨肽的含量，电泳法检测酪蛋白糖巨肽多聚体等。这些检测方法误差大，易受干扰，无法在酪蛋白糖巨肽蛋白食品中精准检测酪蛋白糖巨肽，反映真实的酪蛋白糖巨肽含量。中国发明专利申请号CN201810316627.6，发明名称为“一种A1/A2β-酪蛋白的质谱检测方法”该方法的关键分析条件不适用于酪蛋白水解物等多肽产品中酪蛋白糖巨肽的分析和检测。中国发明专利申请号CN201810487863.4，发明名称为“一种用于检测牛乳品中A2β-酪蛋白含量的特征肽及方法”该方法所用的液相质谱法需要针对A2β酪蛋白的特定氨基酸片段设计处理过程，同时需要引入特定序列的内标肽，存在检测时间长、检测样本数量低、检测成本高等缺点，且该方法中关键的分析方法并不适用于酪蛋白水解物等多肽产品中酪蛋白糖巨肽的分析和检测。中国发明专利申请号CN201911419245.7，发明名称为“质谱检测乳制品中A1和A2型β-酪蛋白的标准特征多肽组”该方法所提取的目标肽段和关键分析条件也不适用于酪蛋白水解物等多肽产品中酪蛋白糖巨肽的分析和检测。

文献“Quantitative determination ofbovine k-casein macropeptide indairy products by Liquid chromatography/Electrospray coupled to massspectrometry(LC-ESI/MS)and Liquid chromatography/Electrospray coupled totamdem mass spectrometry(LC-ESI/MS/MS)”中使用RP-HPLC-ESI-MS技术实现了对A型和B型和总酪蛋白糖巨肽含量的检测，并分析了UV，SIM和MRM三种检测模式在定量总酪蛋白糖巨肽含量时的优缺点，但该法中没有对酪蛋白糖巨肽进行定性分析，且检测总酪蛋白糖巨肽含量仅使用水解酪蛋白糖巨肽后获取的一个多肽段(162-169)，因此可能无法检测出酪蛋白糖巨肽产品的掺假行为，其定量结果也可能产生偏差。