[发明专利]同时检测猴痘和猴B病毒的荧光PCR试剂盒及检测方法

权利要求书

1.同时检测猴痘和猴B病毒的荧光PCR试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含可同时检测猴痘病毒和猴B病毒的引物混合物，检测所述猴痘病毒的引物序列如SEQ ID No.01和SEQID No.02所示；检测猴痘B病毒的引物序列如SEQ ID No.03和SEQ ID No.04所示。

2.根据权利要求1所述的同时检测猴痘和猴B病毒的荧光PCR试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包含非特异性荧光染料，所述非特异性荧光染料为SYBR Green、Eva Green、HelixGreen和LC Green中的一种。

3.根据权利要求1所述的同时检测猴痘和猴B病毒的荧光PCR试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包含PCR buffer，所述PCR buffer包含以下组分：N-Taq DNA聚合酶5-10U；Tris-HCL PH 8.2-8.4 25mM-75mM；KCL 50mM-75mM；MgCl₂ 2.5mM-3.75mM；dATP 2.5mM-7.5mM；dTTP 2.5mM-7.5mM；dCTP 2.5mM-7.5mM；dGTP 2.5mM-7.5mM；甘油2.5％-12.5％；NaN₃0.2％-1％。

4.根据权利要求1所述的同时检测猴痘和猴B病毒的荧光PCR试剂盒，其特征在于，所述PCR buffer包含以下组分：N-Taq DNA聚合酶5U；Tris-HCL PH 8.3 35mM,；KCL 60mM,；MgCl₂ 3mM；dATP 4mM；dTTP 4mM；dCTP 4mM；dGTP 4mM；甘油10％；NaN₃0.5％。

5.根据权利要求1所述的同时检测猴痘和猴B病毒的荧光PCR试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包含阳性对照品和阴性对照品，所述阳性对照品由猴痘病毒和猴B病毒的质粒混合物制备而成，所述阴性对照品由TE缓冲液制备而成。

6.如权利要求1-5任一项所述的荧光PCR试剂盒同时检测猴痘病毒和猴B病毒的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)特异性PCR扩增猴痘病毒和猴痘B病毒；

2)扩增结束后生成溶解曲线以利用溶解曲线Tm值的差异来区分猴痘病毒和猴B病毒。

7.如权利要求6所述的荧光PCR试剂盒同时检测猴痘病毒和猴B病毒的方法，其特征在于，扩增猴痘病毒和猴痘B病毒的扩增体系为：PCR buffer 10-20uL，猴痘病毒和猴B病毒的引物各3-5uL，阳性标准品或阴性对照品或样本格式提取液3-5uL，去离子水5-10uL。

8.如权利要求7所述的荧光PCR试剂盒同时检测猴痘病毒和猴B病毒的方法，其特征在于，用于扩增猴痘病毒的引物浓度为0.4uM，用于扩增猴B病毒的引物浓度为0.35uM。

9.如权利要求6所述的荧光PCR试剂盒同时检测猴痘病毒和猴B病毒的方法，其特征在于，扩增猴痘病毒和猴痘B病毒的扩增程序为5℃预变性20秒；95℃变性5秒，56-62℃退火20秒，共40-45个循环。

10.如权利要求9所述的荧光PCR试剂盒同时检测猴痘病毒和猴B病毒的方法，其特征在于，扩增猴痘病毒和猴痘B病毒的扩增程序为：95℃预变性20秒；95℃变性5秒，60℃退火20秒，共40个循环。