[发明专利]一种用于酶促DNA合成的试剂盒及其应用

说明书

本申请公开一种用于酶促DNA合成的试剂盒及其应用，属于DNA合成领域。本发明公开了一种用于酶促DNA合成的试剂盒，所述试剂盒包括芯片、起始链和末端脱氧核苷酸转移酶，所述芯片含有探针,所述探针为单链DNA分子，所述探针的3'末端被氨基修饰，所述探针包括柔性臂区和与所述起始链结合的结合区，所述柔性臂区由6‑12个T连接而成，所述结合区由20‑30个核苷酸组成，所述结合区的核苷酸序列与所述起始链的5'端反向互补。本发明提供了酶促DNA合成的芯片，该芯片解离效率高、可重复使用，对酶促DNA合成领域具有重要的意义。

技术领域

本申请属于DNA合成领域，具体涉及一种用于酶促DNA合成的试剂盒及其应用。

背景技术

目前DNA合成主要采用20世纪80年代开发的固相亚磷酰胺化学合成法，通过4步循环反应，实现寡核苷酸链从3’到5’方向合成。然而，DNA化学合成技术存在本身瓶颈问题，例如反应步骤繁琐、单个循环耗时较长(6-8分钟)、化学试剂消耗较多且成本较高，大量使用有毒、易燃的有机试剂，污染较大。因此，基于蛋白酶催化的DNA生物合成逐渐成为有望替代化学合成技术的新一代DNA合成技术。

酶法DNA合成技术是指利用不依赖模板的末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)向DNA链末端添加单核苷酸，其合成机理类似与生物体内DNA复制机制，可实现寡核苷酸链从5’到3’方向合成。在存在天然核苷酸的情况下，TdT可以将单链DNA片段延长数千个核苷酸。生物法DNA合成技术具有化学合成法无法比拟的优势，如生物酶的底物特异性和催化效率一般显著高于化学合成法，生物法温和的水相反应条件可以减少副产物的产生。

微流控芯片是微流控技术实现的主要平台。其装置特征主要是其容纳流体的有效结构(通道、反应室和其它某些功能部件)至少在一个纬度上为微米级尺度，从而极大提高反应效率，降低成本。由于DNA化学合成技术与生物合成技术存在显著的原理差异，目前的微流控芯片主要适用于化学合成技术，尚无针对酶法DNA合成技术应用的微流控芯片。

此外，目前已知的利用微流控芯片进行DNA合成的装置普遍存在，探针固定后解离效率不高(使用酶法解离)，步骤繁琐(需要两步酶切)，整体成本较高(所使用试剂较昂贵)，无法重复利用，与后续合成过程连接性不强等缺点。

发明内容

本发明要解决的技术问题1是目前无成熟酶法DNA合成芯片的核心问题，2是芯片上固定的DNA解离效率低，步骤繁琐(需要两步酶切)，整体成本较高(所使用试剂较昂贵)，无法重复利用，与后续合成过程连接性不强等缺点。

为解决上述技术问题，第一个方面，本发明提供一种用于酶促DNA合成的试剂盒，所述试剂盒包括芯片和起始链，

所述芯片含有探针,所述探针为单链DNA分子，所述探针的3'末端被氨基修饰，所述探针包括柔性臂区和与所述起始链结合的结合区，所述柔性臂区由6-12个T连接而成，所述结合区由20-30个核苷酸组成，所述结合区的核苷酸序列与所述起始链的5'端反向互补。

进一步地，上述的试剂盒中，所述探针的长度为26-42nt。

进一步地，上述的试剂盒中，所述起始链包括与所述探针结合的配对区，所述配对区的核苷酸序列与所述探针的结合区反向互补，所述配对区的长度为20-30个核苷酸。

进一步地，上述的试剂盒中，所述起始链还包括位于3'端的用于起始DNA合成的引发区，所述引发区的长度大于3nt。

进一步地，上述的试剂盒中，所述起始链的引发区的长度为4-6nt。

进一步地，上述的试剂盒中，所述探针的核苷酸序列是SEQ ID No.1，所述起始链的配对区的核苷酸序列是SEQ ID No.2第1-25位。