[发明专利]一种用于检测NETs的试剂盒、其制备方法与检测方法

权利要求书

1.一种用于检测NETs的试剂盒，其特征在于，包括溶血素和混合荧光抗体；其中混合荧光抗体包括以下组合：

组合一：组蛋白H3荧光抗体和MPO荧光抗体；或

组合二：组蛋白H3荧光抗体、MPO荧光抗体和CD66荧光抗体；或

组合三：组蛋白H3荧光抗体、MPO荧光抗体和DNA双链特异性荧光染料；

组合四：组蛋白H3荧光抗体、MPO荧光抗体、CD66荧光抗体和DNA双链特异性荧光染料。

2.根据权利要求1所述的用于检测NETs的试剂盒，其特征在于，所述组蛋白H3抗体为抗瓜氨酸修饰组蛋白H3鼠抗人单克隆抗体Ab-CitH3，其针对的抗原序列为瓜氨酸修饰的C末端第1-30氨基酸序列的抗原表位。

3.根据权利要求1所述的用于检测NETs的试剂盒，其特征在于，组蛋白H3荧光抗体、MPO荧光抗体、CD66抗体分别标记不同发射波长的荧光染料。

4.根据权利要求1所述的用于检测NETs的试剂盒，其特征在于，任一组合的试剂盒中，各种抗体的比例值为1。

5.根据权利要求1-4任一项所述的用于检测NETs的试剂盒，其特征在于，还包括用于绝对定量的荧光微球，荧光微球的最终浓度是10⁵-10⁶个/ml。

6.根据权利要求1-5任一项所述的试剂盒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

储存液的配制：

（1）将小牛血清白蛋白溶解于pH=7.4的磷酸盐缓冲液，形成含1%小牛血清蛋白的磷酸盐缓冲液；

（2）加入ProClin 300，使得缓冲液的终浓度为0.03%；

（3）过滤除菌后用于稀释荧光抗体；

组蛋白H3荧光抗体和MPO荧光抗体的制备：

（1）将组蛋白H3抗体和MPO抗体分别用磷酸盐缓冲液稀释为1mg/ml，按10：1的比例加入活化液，震荡均匀后室温孵育10min；

（2）分别加入与抗体质量相等的荧光素，混匀后4℃避光孵育12h，得到荧光抗体；

（3）分别加入十分之一体积的淬灭剂，混匀后室温避光孵育30min；

（4）采用层析柱分别纯化和分离标记好的荧光抗体；

（5）采用琼脂糖扩散法测定抗体效价，比色法测定抗体质量；

（6）将分离纯化后的荧光抗体分别用储存液稀释至100μg/ml，4℃避光保存；

抗体的混合及分装：

将稀释后的组蛋白H3荧光抗体、MPO荧光抗体和浓度为100μg/ml的CD66抗体按1：1：1的比例混合，形成混合荧光抗体，分装在棕色试剂管中，每管含混合荧光抗体1ml；

溶血素的分装：

将溶血素分装到试剂管中，每管5ml；

荧光染料的分装：

将外购的Sytox Green或Sytox Orange溶于二甲亚砜中，使得浓度为1mM，分装于棕色试剂管中，每管1ml，避光保存；

试剂盒的包装：

取上述分装好的混合荧光抗体、溶血素、荧光染料各一管，装入一个包装盒中，放入一份说明书，封好盒子，打印生产批号和有效期限，质检合格后2-8℃保存。

7.一种采用权利要求1-5任一项所述的试剂盒或权利要求6所述的制备方法制备的试剂盒用于检测NETs的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤一：取10-30μl的混合荧光抗体和DNA双链特异性染料加入流式细胞仪专用试管中；

步骤二：将20-100μl的全血标本中加入混合荧光抗体中，轻轻混匀，并避光孵育15-25分钟；

步骤三：向试管内加入0.3-1.5ml的溶血素，轻轻混匀，避光孵育10-20分钟；

步骤四：加入荧光微球；

步骤五：采用流式细胞仪进行检测。