[发明专利]一种高热稳定性和高活性的胃蛋白酶突变体设计方法

说明书

本发明涉及基因工程技术领域，公开了一种为了解决胃蛋白酶热稳定性及活性的问题，从而提出了一种针对胃蛋白酶活性和热稳定性的高效理性设计方法。主要从计算机理论计算快速虚拟筛选突变体，然后使用多重实验验证酶催化结果两方面进行。选取具有高温活性、稳定性和广泛pH稳定性的胃蛋白酶进行一系列理性计算，筛选出潜在的热稳定性和高活性的突变体；利用毕赤酵母表达系统进行异源表达，利用纯化后的重组胃蛋白酶测定热稳定性和酶活性，最终筛选出具有最高热稳定性和活性的胃蛋白酶突变体。对为未来胃蛋白酶的工业化生产和应用具有重要的指导意义。

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种高热稳定性和高活性的胃蛋白酶突变体设计方法。

背景技术

胃蛋白酶是一种胃肠系统的消化蛋白酶，由胃蛋白酶原制成，由消化器官中的胃粘膜祖细胞分泌，然后由胃蛋白酶促进。其主要目的是将膳食蛋白质分解成肽。胃蛋白酶作为一种酸性蛋白酶现在可用于生物制药和食品加工行业。胃蛋白酶可用于治疗胃肠道疾病，是生物制药领域的常用药物。在食品加工业中，它通常用于酸奶酿造和饮料澄清。胃蛋白酶，主要来源于微生物分泌物和动物器官，是一种适用于将动植物蛋白质水解成氨基酸和小分子肽的酶，pH为2.0～5.0，分子量为30～40kDa，由两个天冬氨酸残基组成活性中心。由于胃蛋白酶具有良好的耐酸性，在水解过程中不易发生因细菌繁殖引起的蛋白质变质，所以在生产生活中有广泛的应用前景。如今报道的胃蛋白酶大多酶学性质不稳定，酶活性低，在一定程度上限制了酸性蛋白酶的后续应用。工业生产中使用的大多数胃蛋白酶都是分枝杆菌来源的，这些酶中的大多数不耐热。当温度高于50℃时，酶活性会急剧下降或失活。此外，这些酶的最适pH一般在3左右。当pH升高时，酶活性显着降低，这也限制了酸性蛋白酶的应用。

近年来，基因工程技术发展迅速，酵母菌作为表达外源蛋白的工程菌越来越受到关注。酵母作为一种单细胞真核生物，不仅具有原核生物生长快、实验操作简单可行的特点，而且具有真核表达系统特有的基因表达调控和蛋白质修饰等功能，克服了原核生物生长速度慢的缺点。原核表达系统产物的活性以及包涵体易变性强、难以复制。酵母的分泌产物与天然蛋白质相似，可通过高密度发酵培养，生产成本显着降低。因此，毕赤酵母现在被广泛应用于外源蛋白的表达。基于对酶蛋白结构和操作的透彻了解，合理设计是一种改变酶分子的技术，主要通过靶向突变技术和靶向饱和突变技术。随着研究的进行，新的稳定的酶的发现以及我们对这些酶如何保持其稳定性的理解使得通过合理设计改变酶分子以增加稳定性变得具有理论意义。此外，增加胃蛋白酶活性和热稳定性具有重要的工业应用，因为缺乏高活性菌株和低热稳定性限制阻碍了其在生产中爆发式的应用。选择具有优良酶学特性的胃蛋白酶，然后对其进行合理修饰以提高其胃蛋白酶活性和热稳定性，是食品加工和医药领域的关键步骤。

发明内容

本发明的目的是为了解决胃蛋白酶热稳定性及活性的问题，提供了一种高热稳定性和高活性的胃蛋白酶突变体设计方法。主要从计算机理论计算快速虚拟筛选突变体，然后使用多重实验验证酶催化结果两方面进行。选取具有高温活性、稳定性和广泛pH稳定性的胃蛋白酶进行一系列理性计算，筛选出潜在的热稳定性和高活性的突变体；利用毕赤酵母表达系统进行异源表达，利用纯化后的重组胃蛋白酶测定热稳定性和酶活性，最终筛选出具有最高热稳定性和活性的胃蛋白酶突变体。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一种高热稳定性和高活性的胃蛋白酶突变体设计方法，包括以下步骤：

(1)选择特定来源的目标胃蛋白酶，获取其核苷酸序列和对应的氨基酸序列，然后构建目标胃蛋白酶的三维结构，使用动力学模拟软件进一步对目标胃蛋白酶三维结构进行足够长时间尺度的动力学模拟，以弛豫该蛋白质结构，直至体系结构(RMSD)达到稳定，选取模拟过程中稳定阶段的结构，作为下一步设计改造的初始结构；

(2)基于步骤(1)确定的胃蛋白酶三维结构对目标胃蛋白酶进行结构特征分析，结合胃蛋白酶催化机制确定潜在的能够提高热稳定性和活性的区域；