[发明专利]一种气道上皮细胞SHP-1基因特异性敲除小鼠模型的构建方法及其应用

说明书

本发明提供了一种气道上皮细胞SHP‑1基因特异性敲除小鼠模型的构建方法及其应用。本发明基于CRISPR/Cas9技术，对SHP‑1靶基因进行定点修饰，构建Flox小鼠(SHP‑1supgt;fl/fl/supgt;)，再利用气道上皮细胞Clara蛋白启动Cre系统诱导SHP‑1特异性敲除，构建了一种气道上皮细胞SHP‑1基因特异性敲除的小鼠模型(SHP‑1supgt;Δ/Δ/supgt;)。本发明中所述SHP‑1supgt;Δ/Δ/supgt;小鼠的构建方法解决了传统基因敲除技术中基因脱靶率高、动物成活率低的问题，所得基因编辑小鼠模型在支气管哮喘、慢性阻塞性肺疾病或肺纤维化等呼吸系统重大慢性疾病的机制探索及药物制备方面具有重要临床转化价值。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种气道上皮细胞SHP-1基因特异性敲除小鼠模型的构建方法及其应用。

背景技术

目前，进行基因功能研究最直接有效的方法是构建转基因和/或基因敲除动物模型。CRISPR/Cas9技术通过导向RNA(sgRNA)介导核酸内切酶Cas9蛋白进行靶向DNA序列识别并造成DNA双链断裂，以同源重组或非同源末端连接方式修复受损DNA，从而实现对目标位点实现基因的定点敲除和/或敲入等多种修饰。

条件性基因敲除动物模型主要是通过特异性重组酶系统Cre-LoxP来实现，将带有特定flox位点的转基因小鼠与细胞特异性表达Cre酶的转基因小鼠杂交可以获得特定组织细胞中基因敲除的小鼠。这种条件基因敲除的方法需要同时构建两种转基因小鼠(Flox小鼠和Cre小鼠)，且更换Cre酶的基因启动子可以实现多种条件(如药物诱导、特定时间、特定组织等)下基因敲除。

Src同源区2蛋白酪氨酸磷酸酶-1(Src Homology 2domain-containing proteintyrosine Phosphatase-1，SHP-1)，由PTPN6(SHP-1、PTP1C、HCP)基因编码。SHP-1高表达于造血细胞，而低表达于上皮细胞，对于多种细胞因子、生长因子受体和免疫受体具有负调节作用。有文献报道，全身性SHP-1功能缺陷小鼠肺组织中可出现自发性Th2型炎症反应，包括嗜酸性粒细胞增多症、粘液化生、气道上皮细胞肥大、气道高反应性、上皮细胞和肺纤维化等。

目前，气道上皮细胞SHP-1在哮喘、慢阻肺或肺纤维化等呼吸系统重大慢性疾病中的功能尚不清楚。因此，提供一种构建气道上皮细胞SHP-1基因特异性敲除小鼠的模型，对于研究哮喘、慢阻肺和肺纤维化等具有重要意义。

发明内容

针对现有技术存在的不足，本发明的目的在于提供一种气道上皮细胞SHP-1基因特异性敲除小鼠模型的构建方法及其应用。本发明基于CRISPR/Cas9技术，通过同源重组的原理，对SHP-1靶基因进行定点修饰，构建Flox小鼠，再与CC10-CreER工具鼠杂交，筛选基因型为CC10-CreER^+/-×SHP-1^fl/fl的SHP-1^Δ/Δ小鼠，再利用气道上皮细胞Clara蛋白(CC10)启动Cre系统诱导SHP-1特异性敲除，构建了一种气道上皮细胞SHP-1基因特异性敲除的小鼠模型。本发明中所述SHP-1^Δ/Δ小鼠的构建方法基于CRISPR/Cas9技术，解决了传统基因敲除技术中基因脱靶率高、动物成活率低的问题，筛选出气道上皮细胞SHP-1基因特异性敲除的纯合后代，在哮喘、慢阻肺、肺纤维化等呼吸系统重大慢性疾病机制研究及药物制备方面具有重要应用价值。

为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：

第一方面，本发明提供一种靶向小鼠SHP-1基因的sgRNA，所述sgRNA的核苷酸序列包括SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2。

在本发明中，所述靶向小鼠SHP-1基因的sgRNA的作用位点为SHP-1基因Exon2-Exon9的侧翼区域，所述sgRNA的编辑效率高，脱靶率低，1loxp同源重组效率为18.18％，而对应编号的2loxp全部实现同源重组(效率为100％)。