[发明专利]一种水凝胶型细胞膜半制备色谱柱及其制备方法与应用

权利要求书

1.一种水凝胶型细胞膜半制备色谱柱，其特征在于，所述的色谱柱以水凝胶包裹修饰γ-MAPS的硅球为载体，对以血管内皮生长因子为靶点的化合物具有专属性。

2.一种如权利要求1所述的水凝胶型细胞膜半制备色谱柱的制备方法，其特征在于，所述的方法包括如下步骤：

合成水凝胶型复合固定相：以SiO₂硅球为载体，经过酸碱处理，以γ-MAPS硅烷化试剂为功能单体，通过溶胶-凝胶法制得修饰的硅球SiO₂@MAPS；按交联度0.2％-0.3％，凝胶度4.5％-5.0％，均为质量百分比，称取丙烯酰胺、N,N-二甲基酰胺和100-200mgSiO₂@MAPS，密闭分散于0.01-0.03M pH 6.0-6.5的磷酸盐缓冲液中，震荡混匀后，预聚合l-2h，超声脱气，加入反应催化剂过硫酸铵和四甲基乙二胺，室温磁力搅拌反应20-30h后,离心，弃上清，得水凝胶型复合固定相SiO₂@MAPS@hydrogel；

制备水凝胶型细胞膜色谱柱：取(8-12)×10⁷对数期血管内皮细胞，高压破碎细胞，时间不少于5s，破碎的匀浆离心，其沉淀使用4-8倍体积的细胞裂解液混匀，反复冻融3-5次，高速冷冻离心，取上清液；上清再次高速冷冻离心15-25min后，沉淀用生理盐水混悬，将细胞膜混悬液与上一步制备的水凝胶型复合固定相在真空震荡条件下反应10-15min，冰水浴磁力搅拌1-2h,2-8℃静置过夜，形成细胞膜固定相；采用湿法装柱法将水凝胶型固定相填充至半制备液相空柱，得SiO₂@MAPS@hydrogel-co-HUVEC/CMC半制备色谱柱；

评价细胞膜色谱柱性能：以阴性药、阳性药为对象，对细胞膜色谱柱的专属性、重现性及稳定性进行考察；同时评估其竞争置换能力。

3.一种基于权利要求1所述的水凝胶型细胞膜半制备色谱柱的筛选和纯化系统，其特征在于，所述的系统由半制备液相色谱系统、馏分收集器、液相色谱和四级杆-飞行时间质谱仪组成，由工作站控制；

所述的半制备液相色谱为第一维色谱，采用SiO₂@MAPS@hydrogel-co-HUVEC/CMC半制备色谱柱，流动相：溶剂A为8-12mM PBS溶液，溶剂B为含有0.8-1.2μM埃罗替尼的8-12mM PBS溶液；切换程序：0-10min A:B＝100:0，10.01min-30min A:B＝0:100，收集10-30min馏分；

所述的液相色谱为第二维色谱，采用InetrSustain Swift C18色谱柱，进行梯度洗脱；

采用四级杆-飞行时间质谱仪对纯化后的活性成分进行鉴定。

4.一种如权利要求1或2所述的水凝胶型细胞膜半制备色谱柱在筛选、纯化和鉴定中药活性成分中的应用。

5.一种如权利要求3所述的筛选和纯化系统在中药活性成分筛选、纯化和鉴定中的应用。

6.一种如权利要求3所述的筛选和纯化系统在青黛活性成分筛选、纯化和鉴定中的应用。