[发明专利]一种去除病毒样本中支原体污染的方法

说明书

本发明公开了一种去除病毒样本中支原体污染的方法。通过将病毒传代培养，提高病毒的滴度，后续对病毒液使用0.1um滤器处理及蚀斑纯化，能有效的去除支原体污染，盲传10代也没有出现阳性。本发明一些实例的方法，在去除病毒样本中支原体的过程中，不需要使用药剂，具有更高的安全性，特别有利于疫苗的生产。本发明一些实例的方法，可以得到单个病毒颗粒。

技术领域

本发明属于生物领域，具体涉及一种去除病毒样本中支原体污染的方法。

背景技术

支原体(Mycoplasma)又称霉形体，是目前发现的最小的最简单的，能在细胞外生存的一类缺乏细胞壁原核细胞型微生物，大小一般在0.3～0.5um之间，呈高度多形性，有球形、杆形、丝状，分枝状等多种态。通常依附在细胞膜表面，支原体没有刚性的细胞壁，因此普通的抗生素对它根本不起作用。它不同于细菌，也不同于病毒，种类繁多，分布广泛，造成的危害相当大，涉及人、动物、植物及昆虫等多个领域，给人类健康和科研工作带来不利影响。从人体分离的16种支原体中，肺炎支原体、解脲支原体、人型支原体、生殖支原体及发酵支原体等5种支原体对人有致病性。

在新发传染病大规模流行时期，疫苗免疫被认为是防控疫病最有效的手段之一。灭活疫苗合成途径相对简单、快速，能短时间内迅速的建立起人群免疫。但这些疫苗绝大部分为病毒类疫苗，需要先分离病毒，而在采集病人样本时大部人群均是支原体携带者。目前灭活疫苗的毒种库检定要求支原体必须是阴性，所以这就要求我们在病毒纯化过程中必须去除支原体对毒种库的影响。

目前在市场销售的支原体清除剂大多数都是使用在清除细胞支原体污染的，并没有病毒专用的支原体清除剂。有文献报道用商品化支原体清除剂能对猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus,PRRSV)污染支原体的起到净化效果^【1】；张雅会等采用一种联合过滤和用Plasmocin两种方法，能有效去除PCV2病毒中的支原体^【2】。以上的研究都是基于动物源病毒中支原体清除的方法研究，而研究人源病毒特别是在新型冠状病毒中支原体去除的研究很少。以往在做灭活疫苗候选株筛选时遇到支原体阳性的样本都是采用淘汰的方式，但是在遇到样本来源单一，无法替代的情况下，就不可避免的要对样本或毒株进行支原体清除。开发一种有效去除病毒样本中支原体的方法，具有非常实际的意义。

参考文献：

[1]胡晓凤,王家福,尹忠良,康斌,李建林,李少丽.猪繁殖与呼吸综合征病毒污染支原体的清除[J].国外畜牧学(猪与禽),2021,41(04):34-36.

[2]张雅会,李少丽,李艳丽.一种去除猪圆环病毒中支原体污染的方法[J].现代畜牧兽医,2016(08):42-44.。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的至少一个不足，提供一种去除病毒样本中支原体污染的方法。

本发明所采取的技术方案是：

一种去除病毒样本中支原体污染的方法，包括如下步骤：

S1)将病毒样本接种至不含支原体的含血清的宿主细胞中、传代培养，提高病毒的滴度；

S2)选用0.1um滤器过滤病毒液、使用稀释液稀释过滤后的病毒液，分别加样于不同孔中的单层宿主细胞内吸附；

S3)吸附完毕后加覆盖液，待基本凝固后移入培养箱内培养；

S4)选取具有无色蚀斑的培养物，吸取蚀斑，加入稀释液，得到无支原体污染的病毒样本。

在一些方法的实例中，步骤S1)中，提高病毒的滴度不低于10^-6TCID₅₀/ml。