[发明专利]一种诱导干细胞体外定向分化的方法

说明书

本发明属于干细胞培养技术领域，具体涉及诱导干细胞向神经细胞定向分化的培养基及方法，所述培养基包含：EGF；IL‑6；PRG4蛋白和基础培养基。采用本发明培养基诱导脐带间充质干细胞10天后，神经细胞分化比例达到92.5％，制备获得的神经细胞中神经特异性标志nestin、p‑TubulinⅢ、NSE和GFAP呈阳性。

技术领域

本发明属于干细胞培养技术领域。涉及一种诱导干细胞体外定向分化的方法；更具体地涉及体外诱导干细胞定向分化为神经前体细胞或神经细胞的方法。

背景技术

针对于神经元损伤和功能丧失等中枢神经系统的疾病，如脑梗塞、阿尔兹海默病(AD)、帕金森病(PD)等，目前尚无促进神经细胞再生的有效方法，所以细胞替代疗法是治疗神经功能缺失最有前途的治疗策略之一。

蛋白多糖(proteoglycan4,PRG4)是分子量约为227.5KDA的糖蛋白，最早由Swann等^[1]发现并将之命名为润滑素(lubricin)，由prg4基因(由12个外显子组成)所编码^[2]，也被称为proteoglycan4(PRG4)。目前，对于PRG4具有诱导干细胞定向分化为神经前体细胞或神经细胞的可能，迄今尚未见报道。

[1]Swann DA，Slayter HS，Silver FH.The molecular structure of lubricating glycoprotein-I,the boundary lubricant for articular cartilage[J].J BiolChem,1981,256(11):5921-5925.

[2]Gleghon JP，Jones AR,Flannery CR,et al.Boundary mode lubrication ofarticular cartilage by recombinant human lubricin[J].J Orthop Res,2009,27(6):771-777.

发明内容

已知某些细胞因子与神经系统的发育及神经分化密切相关，EGF能够促进神经前体细胞的存活和增殖，但是申请日前未见EGF在诱导非神经组织来源的干细胞定向分化为神经细胞方面的报道。

并且，也通过试验证实了，单独的EGF并不具有足够强的诱导非神经组织来源的干细胞定向分化成某一类型细胞或者说是神经细胞的能力，而IL-6不具有明显的促进非神经组织来源的干细胞分化为神经前体细胞或神经细胞的作用，但意外地，当EGF与IL-6联合诱导非神经组织来源的的干细胞时，则可以观察到强的诱导向神经干细胞分化的能力，因此，推测EGF与IL-6结合时对促进干细胞定向分化为神经细胞有协同作用。并且意外观察到，随着IL-6的浓度降低，这种协同的效应越强，超出本发明限定的浓度范围时则观察不到强的协同效应。

本发明表2和表3显示了，EGF与IL-6联合诱导非神经组织来源的干细胞时，神经细胞分化比例为52.4％，且制备获得的神经细胞中神经特异性标志nestin、p-TubulinⅢ、NSE和GFAP呈阳性，4个特异性标志的相对表达量显著高于单独添加EGF组和单独添加IL-6组，显示两者在诱导间充质干细胞定向诱导方面存在协同作用。

由此，本发明其中一个发明目的是提供一种诱导干细胞向神经细胞定向分化的培养基，所述培养基包含：

EGF；

IL-6；和

基础培养基。

在本发明其中一个实施方式中，所述培养基包含：

10～20ng/mL EGF；

1～3ng/mL IL-6；和

余量的基础培养基。

在本发明其中一个实施方式中，所述培养基包含：