[发明专利]一种基于Tn558转座子构建的能表达荧光的自杀型质粒、构建方法及应用

说明书

本发明属于基因工程技术领域，具体公开了一种基于Tn558转座子构建的能表达荧光的自杀型质粒、构建方法及应用。该自杀型质粒的构建方法包括：将Tn558和sfGFP进行重叠PCR得到Tn558::sfGFP片段，该片段与用BamHI单酶切后的线性化质粒pZ‑oriTRP4进行重组得到最终的自杀质粒pTn558‑GFP‑oriTRP4。将上述自杀质粒转化至大肠杆菌WM3064感受态细胞，得到大肠杆菌供体菌，可将其与金黄色葡萄球菌受体菌株共培养，构建金黄色葡萄球菌荧光菌株。本发明构建的基于金黄色葡萄球菌染色体radc基因定点荧光标记菌株方法效率较高，可用于构建耐药荧光菌株、药动药效学评价或筛选药物中。

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种基于Tn558转座子构建的能表达荧光的自杀型质粒、构建方法及应用。

背景技术

金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus，S.aureus)也称“金葡菌”，作为革兰氏阳性菌代表，金葡菌是当今在医院感染中引发人类和动物产生许多疾病的重要病原菌，也是普遍导致上、下呼吸道感染的致病菌。金葡菌能够产生引起食物中毒的金黄色葡萄球菌肠毒素，也能够产生杀白细胞和葡萄球菌溶血素等致病因子，对世界性的公共卫生产生严重的威胁。急需构建可以直接观察活体生物体内的细菌运动和基因行为，可以观测到疾病发展进程以及进行药动药效学评价荧光报告系统。例如，(崔长征et al.，2011年)将绿色荧光蛋白基因插入到多环芳烃降解菌株中，进一步研究降解菌在污染环境中的存活能力，为生态安全奠定了基础。(钟卫鸿et al.，2011年)应用绿色荧光蛋白基因标记细菌进行生物膜结构定量化研究。(Getino.et al.，2016年)通过将LUX基因簇克隆在pR388的w型质粒上，构建了高通量评价质粒接合效率系统，研究影响质粒接合的原因并筛选了上千种质粒抑制剂。

目前构建荧光标记细菌的方法：一是靶标在细菌染色体上，利用同源重组的方法，对细菌的染色体进行精准修饰并替换上荧光基因(GFP/RFP/LUX)。该技术需要清楚了解靶位点的基因序列，技术要求较高；二是通过同源重组、酶切、连接等克隆技术构建含有荧光基因的质粒，将该含有荧光基因的质粒导入目标菌株中，该技术构建的工程质粒具有不稳定性，其次需要考虑所选工程质粒载体的拷贝数，防止产生细菌代谢负荷。

原核生物和真核生物基因组中存在着一种可以在基因组中移动的DNA序列，被称为转座子。转座子是基因组内相对独立的、可移动序列，他们不必借助质粒或噬菌体等载体就可以从一个位置“跳跃”到另一个位置，从而产生基因突变。Tn558由编码转座酶基因tnpABC，氟苯尼考-氯霉素外排蛋白fexA基因和假定的氧化还原酶组合成全长6644bp的转座基因。Tn558作为Tn554家族转座基因，其优先插入葡萄球菌或肠球菌的染色体上编码DNA修复蛋白的radC基因。

发明内容

针对现有技术中的不足，本发明首要目的在于提供了一种基于Tn558转座子构建表达荧光的自杀型质粒的方法。

为实现上述目的，本发明通过以下技术方案进行实现：

一种基于Tn558转座子构建表达荧光的自杀型质粒的方法，包括如下步骤：

S1、扩增或合成以下片段：

片段一：Tn558的编码转座酶基因tnpABC；

片段二：pLZ002的编码绿色荧光蛋白基因sfGFP；

片段三：氟苯尼考耐药基因fexA；

将以上三段片段电泳并分别回收；将回收后的三段片段按照摩尔比为1:1:1的比例进行重叠PCR后电泳，并回收片段大小为7333bp的产物；

S2、将质粒pZ-oriTRP4通过BamHI单酶切，然后电泳并回收片段大小为2825bp的产物；